UPLC建立芍药甘草汤指纹图谱及测定多种水溶性活性成分的含量△

吕欣锴，路娟，郑巧，柴瑞平，俞月，邓明慧，李海涛，陈曦*

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100

芍药甘草汤是由白芍、甘草配伍而成的中药复方汤剂，其应用历史悠久，疗效显著，早在汉代张仲景所著《伤寒论·辨太阳病脉证并治》中便有记载[1]。方中白芍苦、酸，微寒，养血敛阴、滋养筋脉；甘草甘，平，善入太阴、补脾益气，两者相伍，酸甘化阴，制胜脾胃[2]，共奏调和肝脾、缓急止痛之功效。现代药理研究表明，芍药甘草汤具有抗炎镇痛[3-4]、保肝利胆等功效，临床常用于多种痛症及炎症性疾病的治疗[5]。

2018年4月，芍药甘草汤成为《古代经典名方目录(第一批)》所载方剂[6]，使芍药甘草汤成为近两年的研究热门。目前已有学者建立了芍药甘草汤的HPLC检测方法及方中药材、饮片的部分物质基准[7]，但此法耗时较长；还有学者建立了超高效液相色谱法(UPLC)检测方法，但对多批次药材的质控并未进一步检测与分析[8]。本文建立了同时检测多批次芍药甘草汤水煎液中7种活性成分的UPLC方法。基于实验室前期对芍药甘草汤指纹图谱的考察，进一步完善方法，旨在对其整体化学成分研究及药效物质基准进一步发掘，为芍药甘草汤的新剂型开发及临床应用提供一定参考。

1 材料

1.1 仪器

Waters UPLC H-Class 系统；AB265-S 分析天平(瑞士METTLER公司)；JA11002 电子天平(上海菁海仪器有限公司)；2-16R 台式高速微量冷冻离心机(上海托莫斯科学仪器有限公司)；奇俞牌智能煎药壶(2.5 L)(深圳市时光主语实业发展有限公司)；各种规格移液枪(Eppendorf公司)。

1.2 试药

白芍和甘草饮片经北京协和医学院药用植物研究所云南分所李海涛教授鉴定均为正品，且符合 2015年版《中华人民共和国药典》标准。根据药材批号，将饮片随机组合用于制备 11 批次芍药甘草汤样品，饮片具体信息见表1。

表1 白芍及甘草饮片信息

甲醇、乙腈(Merck公司)；磷酸(西陇化工股份有限公司)；对照品甘草苷(批号：180305)、异甘草苷(批号：180427)、异甘草素(批号：180321)、芹糖基异甘草苷(批号：170706)、甘草酸铵(批号：180402)、芍药苷(批号：180302)、芍药内酯苷对照品(批号：180216)均购于上海融禾医药科技有限公司，纯度>98%；实验用水为屈臣氏蒸馏水。

2 方法及结果

2.1 色谱条件

Waters Xselect Hss T3 色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)；梯度洗脱(0～5 min，10%～11.3%A；5～30 min，11.3%～100%A)；流速0.3 mL·min-1；柱温40 ℃；二极管阵列检测器(PDA)定时波长处理：0～18 min，230 nm，18.01～30 min，250 nm；进样量：2 μL。

2.2 供试品溶液的制备

《伤寒论》中记载芍药甘草汤的用法用量：白芍药、炙甘草各四两。上二味，以水三升，煮取一升五合，去滓，分温再服[9]。按照汉代一两等于15.5 g，一升等于200 mL，一合等于20 mL计算。称取甘草、白芍各62 g，加水600 mL，浸泡30 min，用煎药壶先武火20 min，再文火40 min进行煎煮至300 mL。经纱布(8层)过滤后，取适量滤液，10 000 r·min-1(离心半径为 6 cm)，4 ℃，离心10 min，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，滤液用甲醇稀释5倍，即得。其余样品-20 ℃冷冻储存。根据此法，由不同产地批次饮片制得的11批次芍药甘草汤，具体见表2。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取芍药内酯苷、芍药苷、甘草酸铵、芹糖基异甘草苷、异甘草素、异甘草苷、甘草苷对照品5 mg，用纯甲醇定容，制得7个质量浓度为1 mg·mL-1的对照品储备液。精密吸取0.5 mL芍药内酯苷储备液、2 mL芍药苷储备液、1 mL甘草酸铵储备液、0.2 mL芹糖基异甘草苷储备液、0.2 mL异甘草素储备液、0.3 mL异甘草苷储备液、0.8 mL甘草苷储备液于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制得混合对照品溶液。分别精密吸取适量混合对照品储备液，用甲醇定容配制成不同浓度的对照品溶液。4 ℃存放备用，测定前使用0.22 μm微孔滤膜过滤。

2.4 方法学考察

2.4.1精密度试验 精密吸取芍药甘草汤对照品溶液，按2.1项下色谱条件，连续进样6次，记录峰面积，计算RSD。结果测得芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、芹糖基异甘草苷、异甘草苷、异甘草素、甘草酸铵峰面积的RSD分别为1.68%、2.18%、2.09%、2.64%、2.15%、1.21%、1.79%，表明仪器精密度良好。

2.4.2重复性试验 取S1批次供试品溶液，按2.1项下测定，连续进样6次，记录峰面积，计算RSD。结果测得芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、芹糖基异甘草苷、异甘草苷、异甘草素、甘草酸铵峰面积的RSD分别为0.77%、0.94%、0.60%、2.68%、0.85%、0.72%、0.55%，表明本方法重复性良好。

2.4.3稳定性试验 取S1批次供试品溶液，分别于第0、2、4、6、8、12 h，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算RSD。结果测得芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、芹糖基异甘草苷、异甘草苷、异甘草素、甘草酸铵峰面积的RSD分别为0.25%、1.36%、1.20%、8.39%、11.33%、14.51%、0.60%，表明供试品溶液中各成分在12 h 内稳定性良好。

2.4.4专属性考察 按照2.2项下记录的供试品溶液制备方法分别制备甘草和芍药的单味样品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图1。

注：A.空白溶剂；B.混合对照品；C.单味甘草水煎液；D.单味白芍水煎液；E.S1批次全方；F.S1批次全方局部放大图；1.芍药内酯苷；2.芍药苷；3.甘草苷；4.芹糖基异甘草苷；5.异甘草苷；6.异甘草素；7.甘草酸铵。图1 PDA定时波长处理后芍药苷汤样品及混合对照品色谱图

2.4.5加样回收率试验 精密吸取已知含量的S1批次供试品溶液3份，分别加入已知含量的混合对照品溶液，使得到的混合对照品中化学成分浓度为已知样品中化学成分浓度的80%、100%、120%。用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液。然后按照2.1项下色谱条件每个混合对照品溶液重复进样3次，计算回收率和RSD。结果芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、芹糖基异甘草苷、异甘草苷、异甘草素、甘草酸铵平均回收率分别为93.77%、94.16%、105.62%、103.81%、92.57%、90.87%、91.25%，RSD分别为1.21%、0.07%、0.81%、4.06%、2.72%、0.81%、0.81%，表明本方法准确可靠，此法加样回收率良好。

2.5 11批次芍药甘草汤指纹图谱的建立及相似度评价

2.5.1指纹图谱的建立 将11批次处理好的芍药甘草汤UPLC图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2004 A版进行色谱峰匹配，得到指纹图谱，经处理后共标定59个共有峰，其中43号色谱峰分离度较好，峰面积较大且稳定，保留时间合适，故确定43号色谱峰为参照峰。并指认出7个共有峰，分别为芍药内酯苷(14号峰)、芍药苷(15号峰)、甘草苷(17号峰)、芹糖基异甘草苷(28号峰)、异甘草苷(29号峰)、异甘草素(39号峰)、甘草酸铵(41号峰)，11批次芍药甘草汤UPLC指纹图谱见图2。

图2 11批次芍药甘草汤UPLC指纹图谱

2.5.2相似性评价结果 利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2004 A版软件计算分析，得到11批芍药甘草汤供试品色谱图的相似度，具体数据见表3。根据结果，11批次相似度>0.98，表明此11批次间差异较小，甘草3个产地5个批次及白芍2个产地4个批次的饮片质量较为均一。

2.6 11批次芍药甘草汤中7种水溶性成分线性关系考察及含量测定

为进一步对不同产地批次药材进行分析，我们对11批次芍药甘草汤中已指认的7种成分进行了含量测定。首先以对照品的质量浓度(μg·mL-1)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，建立各成分标准曲线，得到回归方程和r，结果见表4。根据标准曲线，计算各批次芍药甘草汤中7种水溶性成分的含量，结果见表5。结果表明，各产地各批次药材的各成分含量存在差异，但总体而言差异较小，此结果与相似度评价结果趋于一致。

3 讨论

芍药甘草汤是由芍药、甘草配伍所得，两者协同共奏调和肝脾、柔筋止痛之功效，其化学成分复杂多样，研究表明[11]，芍药甘草汤的原方入血成分多达17种，因此对原方中化学成分的整体研究显得尤为重要。将芍药、甘草中较为稳定且分离良好的7种成分作为本实验考察重点，其中5种成分来自甘草，2种成分来自芍药，包括了芍药苷、甘草苷、异甘草苷、甘草酸等重要药效物质基础[12]。

表3 11批芍药甘草汤供试品色谱图中色谱图相似度

表4 芍药甘草汤各成分标准曲线及线性范围

注：甘草酸质量=甘草酸铵质量/1.020 7[10]。

实验最初选择乙腈(A)-醋酸-醋酸铵缓冲溶液(pH=4.5)(B)作为流动相，采用梯度洗脱28 min的方法，发现此法波动较大，对部分成分的分离度不佳，影响其含量测定；随后将流动相B改为0.1%的磷酸水溶液，并将梯度洗脱延长至40 min，较前者，此法较为稳定，且分离度均较佳，但前20 min出峰较少，运行时间较长，效率较低；最后调整梯度洗脱程序，将方法稳定在30 min。此法稳定性较佳，峰形较好且简单易行，适用于芍药甘草汤的初步定性定量分析。

本实验的芍药甘草汤是根据古代经典名方开发要求进行制备，其水煎液浓度较高，成分复杂，且不同成分的最大紫外吸收存在差异。根据实验及查阅文献发现，芍药内酯苷、芍药苷、芹糖基异甘草苷、异甘草苷、甘草苷这5种成分在230 nm附近响应较高[13-14]，甘草酸铵和异甘草素的最大吸收波长于250 nm左右[15]，而单一在230 nm或250 nm下部分峰响应较低，因此很难在单一波长下对其整体化学成分进行表征。故最终选择二极管阵列检测器(PDA)定时波长：0～18 min，230 nm；18.01～30 min，250 nm。此波长下基线平稳，峰响应值较高。

本文建立了同时检测芍药甘草汤中7种水溶性成分的超高效液相色谱法(UPLC)，通过建立了指纹图谱、相似度评价分析，发现由甘草3个产地5个批次、白芍2个产地4个批次饮片制得的11批芍药甘草汤的相似度均大于0.98，表明该11批次芍药甘草汤样品间差异较小，制备工艺较为稳定。随后对 11批次样品进行含量测定，发现2个产地共4批次白芍、3个产地5批次甘草中各成分含量差异较小，RSD<15%，此结果与相似度评价结果趋于一致。综上所述，本研究从定性、定量的角度，对经典名方——芍药甘草汤的物质基准进行了初步研究，建立了芍药甘草汤稳定、简便的UPLC测定方法，为其进一步基础研究、新剂型发展及临床应用提供参考。

表5 11批次芍药甘草汤中7种成分含量 μg·mL-1