黄芪饮片质量评价和分级标准探讨△

尚兴朴，欧阳罗丹，肖苏萍*，王继永，高永坚，袁春平，刘畅

1.中国中药有限公司，北京 100195；2.中国中药控股有限公司，广东 佛山 528303；3.江西中医药大学，江西 南昌 330004

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、排脓托毒、敛疮生肌之功效[1]。黄芪在我国分布较为广泛，中国大部分地区均有种植，主要产区有内蒙古、山西、甘肃、黑龙江等[2]。黄芪始载于《神农本草经》，原名“黄耆”，列为上品[3]。作为大宗常用药材，应用广泛，含黄芪的中成药品种就有783个，27个剂型，主要用于滋补类的适应症，5013家生产企业生产，单味制剂有黄芪精、黄芪颗粒、北芪片、黄芪精颗粒、黄芪片。含黄芪的保健食品有1050个，剂型有颗粒、胶囊、茶、酒、口服液、浆、片、咀嚼片、泡腾片、冲剂、饮料、袋泡茶、糖浆、膏、浓缩液、浓缩精等。目前临床使用和企业生产的黄芪饮片类型主要有黄芪片、炒黄芪、酒黄芪、盐黄芪、米炒黄芪、酒炒黄芪等，主流炮制品为黄芪片和蜜炙黄芪[4]。目前，由国家中医药管理局与卫生部制定，1984年3月试行的部颁标准《七十六种药材商品规格标准》[国药联材字(84)第72号文]附件中黄芪药材等级的划分方法，至今仍是黄芪药材商品流通领域用于限定黄芪药材商品规格等级的使用标准基础依据。但黄芪饮片尚未有官方规范的等级分类标准。经课题组市场调研得知，黄芪饮片价格与黄芪饮片直径有很大的关系，直径越大，市场价格越高，直径越小，价格越低。

近年来，有少数研究者分别以黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定指标，分析探讨黄芪饮片等级标准制订依据[5-6]。但其对样品等级分级过多，分级标准不清晰，而且以单一成分含量作为评价指标，不能全面评价黄芪质量情况。黄芪首次被《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)收录是在1963年，而后都被历版《中国药典》收录，随着分析技术水平的提高，被收录的质量标准也不断提高。2015年版《中国药典》黄芪饮片项下含量测定为黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷2项检测项[1]，前处理方法分为2个不同部分，且涉及索氏提取、萃取、碱处理、柱层析等过程，十分繁琐，且容易造成测量结果误差大等问题。黄芪主要含有皂苷类和黄酮类，现代药理实验表明，黄芪皂苷类成分具有抗衰老、抗病毒、抗风湿、降压、保护心肌细胞、抗肿瘤、抗肝纤维化等作用[7]，黄芪黄酮类成分具有抗心肌缺血、消除自由基、抗炎、抗突变、抗损伤、抗骨质疏松、影响免疫系统和对肝损伤防护等作用[8]。本课题组对收集于不同生产企业、不同流通市场以及由原药材自行工业大生产加工成饮片的黄芪饮片进行外观指标测定，通过优化改进并新建的黄芪含量测定方法，在测定黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的基础上，增加毛蕊异黄酮、芒柄花苷等成分含量测定，以期为黄芪饮片等级分级、标准制订和质量评价提供理论依据，为黄芪饮片市场价格管控提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器

XS2050U型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；XB620M型电子天平(瑞士Precisa)；1260型高效液相色谱仪、ELSD 2000ES型蒸发光散射检测器(美国奥泰公司)；e2695型高效液相色谱仪、2998光电二极管阵列检测器(美国沃特斯公司)；超纯水仪(Millipore公司)；超声波提取仪(SD2800LHC型，北京中晟铭科技有限公司)。

1.2 试药

黄芪甲苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为：110781-201717、111920-201606)；芒柄花素对照品、毛蕊异黄酮对照品、芒柄花苷对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号分别为：H06S9Z69494、Y24N9Y75652、R28O8F46957)；乙腈、甲醇(色谱纯)；正丁醇(国药集团化学试剂有限公司，批号：沪试10005218)；氨水(国药集团化学试剂有限公司，批号：10002118，分析纯)。

黄芪饮片样品经中国中药有限公司王继永研究员鉴定为豆科植物蒙古黄芪干燥根的切制饮片，经粉碎，过四号筛备用。黄芪饮片样品留存于中国中药有限公司科技研发部。黄芪饮片信息见表1。

表1 黄芪饮片样品信息

注：荷花池市场为成都市荷花池中药材批发市场的简称；玉林市场为广西玉林市中药材专业市场的简称。

2 方法

2.1 黄芪饮片外观指标测定

在借鉴中药材商品规格传统的“辨状论质”理论，依据黄芪切制饮片的特点，选择以平均最窄直径和平均质量作为黄芪饮片的外观指标。先以市场分级和初步观测收集样品大致分级情况，然后从以上每份样品中选取符合初步分级的各100个饮片，分别对每份样品的100个饮片的直径和质量进行测量和称定，取其平均值。

2.2 黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和其他黄酮类成分含量测定

参照课题组新建的方法，对黄芪各样品中的黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷和芒柄花素进行含量测定。

2.2.1对照品溶液制备

2.2.1.1黄芪甲苷 取干燥的黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，质量浓度约为0.5 mg·mL-1。

2.2.1.2毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮混合对照品溶液制备 取干燥的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和毛蕊异黄酮对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度约为1.5 mg·mL-1，芒柄花素、芒柄花苷和毛蕊异黄酮质量浓度约为0.5 mg·mL-1。

2.2.2供试品溶液制备 精密称取黄芪药材粉末(过四号筛)2.0 g，置50 mL离心管中，加甲醇30 mL，超声提取30 min，3000 r·min-1(离心半径为13.5 cm)离心5 min。上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过。残渣用甲醇洗涤2次，每次15 mL，超声提取5 min，离心5 min，滤过，合并上述滤液，用旋转蒸发仪减压蒸干。残渣溶解于10 mL 10%氨水溶液中，放置10 min，不时振摇。将溶液移至分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取3次(15、10、10 mL)。合并提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至2 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.3色谱分析条件

2.2.3.1黄芪甲苷含量测定的色谱条件与方法 以Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱；流动相为乙腈-水(32∶68)；柱温为30 ℃；进样量20 μL；流速为1 mL·min-1。蒸发光散射检测器(ELSD)参数：氮气流速为2.7 L·min-1；漂移管温度为105 ℃；增益为1。

测定法：分别精密吸取对照品溶液10、20 μL，供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。色谱见图1。

2.2.3.2毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮含量测定的色谱条件与方法 色谱柱：Waters XBridge C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.2%甲酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～20 min，80%～60%A，20%～40%B；20～30 min，60%A,40%B，30～40 min，60%A,40%B)；进样量10 μL；流速为1 mL·min-1；检测波长为260 nm；柱温为25 ℃。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。色谱见图2。

注：A.黄芪甲苷对照品；B.黄芪饮片样品。图1 黄芪饮片黄芪甲苷HPLC图

注：A.黄酮类成分混合对照品；B.黄芪饮片样品；1.毛蕊异黄酮葡萄糖苷；2.芒柄花苷；3.毛蕊异黄酮；4.芒柄花素。图2 黄芪饮片黄酮类成分HPLC图

2.3 数据处理

采用SPSS 16.0软件，对不同黄芪饮片外观指标和内在各成分含量进行相关分析、主成分分析和聚类分析，用于外观指标和内在成分指标与饮片划分等级标准研究。

3 结果

3.1 黄芪饮片外观指标测定结果

按2.1项下方法进行测定，结果见表2。

表2 黄芪饮片外观指标

注：平均最窄方向直径指1个类圆形或不规则的切片通常有多个方向的长轴，它们所对应的直径必有1个是最窄的，这个最窄的通常就是原药材的直径[9]；各饮片企业样品含有不同直径大小饮片，本文仅选取占主要直径大小的100个饮片进行测定。

3.2 黄芪饮片有效成分含量

将外观指标测定后的饮片样品按2.2项下方法对每个样品平行制备2份供试品溶液，测定的含量取平均值，测定结果见表3。

表3 黄芪饮片各有效成分含量测定 %

注：*表示含量未达到2015年版《中国药典》要求，△表示含量未达到《江西省中药饮片炮制规范》(2008年版)和《上海市中药饮片炮制规范》(2008年版)(黄芪甲苷≥0.035%)要求。

3.3 黄芪饮片外观指标与有效成分、有效成分之间含量的相关性分析

运用SPSS对饮片外观指标与内在有效成分、有效成分相互之间的相关性进行Pearson相关性分析，结果见表4。由表4可知，黄芪饮片平均最窄直径与平均质量呈显著的正相关，r=0.824，平均最窄直径、平均质量与黄芪甲苷的r=-0.572(P<0.01)和-0.421(P<0.05)，呈中等强度的负相关，说明黄芪饮片直径越大，质量较大，黄芪甲苷含量越低。黄芪饮片外观指标与各黄酮类成分的相关性都较小；黄芪甲苷与各黄酮类成分的相关性也都较小，这可能与黄芪皂苷与异黄酮类次生代谢活性成分生物合成路径中的关键调控酶基因不同有关[10]；但各黄酮类成分之间相关性较为显著：毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量与芒柄花苷含量具有极强的正相关，r=0.852(P<0.01)，与芒柄花素含量呈中等强度的负相关，r=-0.480(P<0.01)。芒柄花苷含量与毛蕊异黄酮含量、芒柄花素含量呈中、强度的负相关，r分别为-0.584(P<0.01)和-0.636(P<0.01)。毛蕊异黄酮含量与芒柄花素含量呈极强的正相关，r=0.911(P<0.01)。以上各黄酮类成分之间显著的相关性可能与异黄酮类次生代谢活性成分生物合成路径中的关键调控酶基因相同有关[10]。同时，提示这4种异黄酮类成分之间可能存在相互转化等情况，目前尚未见相关报道，需进一步的生物合成探索研究揭示。

表4 黄芪饮片等级与各有效成分的相关性分析

注：**表示差异有统计学意义(P<0.01)；*表示差异有统计学意义(P<0.05)。

3.4 主成分和聚类分析

根据相关性分析数据，将外观指标、黄芪甲苷等3个具有显著性相关的指标进行主成分分析和聚类分析。主成分的特征根为2.227，贡献率为74.239%；特征向量依次为平均最窄直径0.942，平均质量0.887，黄芪甲苷含量-0.743，说明主成分有较大的贡献率，从中提取的信息较多。进一步将样品的3个指标进行系统聚类分析(见图3)。图3的谱系图中的距离代表相似度，距离越远差异越大。进一步将确定的3个指标作K-均值聚类分析处理，最终聚类中心值见表5。从表5可知，黄芪饮片平均最窄直径和平均质量与黄芪甲苷质量分数呈负相关关系，直径和质量越大，黄芪甲苷含量越小。

图3 黄芪饮片系统聚类分析图

表5 黄芪饮片K-均值聚类法最终聚类中心值

4 讨论

4.1 黄芪甲苷含量与黄芪外观指标关系

由表4～5可知，黄芪甲苷含量与黄芪外观指标平均最窄直径和平均质量呈负相关关系，即平均最窄直径和平均质量越大，黄芪甲苷含量越低。黄芪甲苷主要存在于根的形成层以外的韧皮部分，随着生长年限的增加，药材根部直径增加，皮部所占比例降低，黄芪甲苷含量也随之降低，此结果与已有研究报道一致[5，11-13]。33批样品中有16批样品的黄芪甲苷含量未达到《中国药典》标准，占比48.5%，未达标率高于牛倩芸等[11]的研究结果(黄芪甲苷未达标率20%)。可能原因是：1)收集的黄芪药材样品大部分为野生和半野生生长方式样品，30批样品中仅有6批为平地移培样品，而根据其研究结果同等级栽培黄芪的黄芪甲苷含量明显低于传统黄芪，而本文除了药材市场来源样品其他均为栽培黄芪；2)根据本课题组药材分级后大生产加工成饮片的黄芪甲苷与黄芪原药材的黄芪甲苷比较分析，饮片的黄芪甲苷含量明显低于原对应药材的黄芪甲苷含量，提示加工过程中对黄芪甲苷有所损失，具体见表6。

表6 黄芪药材与饮片中黄芪甲苷含量比较 %

4.2 黄芪中4种黄酮类成分含量与黄芪外观指标关系

由表4可知，毛蕊异黄酮葡萄糖苷等4种黄酮类成分含量与黄芪外观指标不具有显著相关性，毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量均达到《中国药典》含量要求，其平均值达到0.036%。毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素这3种黄酮类成分，目前在《中国药典》的黄芪项下未规定其检测方法和含量限定，从表4的33批黄芪饮片样品中得出，毛蕊异黄酮平均质量分数为0.010%，芒柄花苷平均质量分数为0.017%，芒柄花素平均质量分数为0.007%。

4.3 黄芪饮片含量测定检测项限度要求

本文中33批样品中有16批样品的黄芪甲苷含量未达到《中国药典》标准，占比48.5%，牛倩芸等[11]研究结果也提出了黄芪甲苷不达标率较高的问题，建议《中国药典》参照地方炮制规范要求，降低黄芪饮片中黄芪甲苷含量要求，即不得少于0.035%。而样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量均达到《中国药典》要求，建议与原来标准保持一致，不得少于0.020%。

毛蕊异黄酮是天然的植物雌激素，其结构与雌激素的结构相似，具有抗病毒、治疗心血管疾病等多种功效，尤其在对恶性肿瘤增殖的抑制作用方面受到广泛关注[14]。芒柄花苷具有促进皮肤生长、清除氧自由基、抑制脂质过氧化、维持血中一氧化氮(NO)浓度和保护缺血再灌注损伤、增强免疫等多种药理活性。芒柄花素具有雌激素样作用及对生殖系统具有一定的安全性，能够调节血脂代谢及改善动脉粥样硬化病变，还具有清除氧自由基、血管平滑肌细胞增殖、治疗非小细胞肺癌等作用[15]。毛蕊异黄酮、芒柄花苷和芒柄花素作为黄芪中主要黄酮类成分，对其定性定量评价与控制，对全面综合分析黄芪质量具有一定的临床指导意义。根据本文33批样品检测结果，建议将毛蕊异黄酮、芒柄花苷和芒柄花素同时收录于《中国药典》黄芪品种的含量测定项下，鉴于三者之间的相关性，限定三者含量之和不低于0.020%。

4.4 黄芪饮片分级标准探讨

目前，《浙江省中药饮片炮制规范》(2015年版)、《江西省中药饮片炮制规范》(2008年版)和《上海市中药饮片炮制规范》(2008年版)对黄芪切制饮片外观性状直径要求为0.5～3.5 cm，而《中国药典》(2015年版)和全国其他省市中药饮片炮制规范均未在黄芪饮片项下对外观性状的直径进行规定。根据本文和其他研究者的研究结果，平均最窄直径和平均质量越大，黄芪甲苷含量越低，建议有关黄芪饮片地方炮制规范去除外观性状的直径要求。

本课题组采用《中国药典》黄芪饮片项下检查、浸出物等项目进行了实验和分析，结果未发现浸出物等质量标准项与饮片外观指标有相关性。本文通过数理统计方法分析得出可作为黄芪饮片等级评价标准的参数有黄芪饮片的最窄直径、质量和黄芪甲苷含量，初步探讨了黄芪饮片外观指标与黄芪甲苷内在指标的关系。在实际应用时，应综合考虑黄芪饮片分级标准的合理性，不仅考虑外观指标，还需考虑黄芪甲苷的内在含量，规范使用，以其指导临床应用和市场交易价格。对于饮片生产企业对原料来源有质量要求的，在各项指标达到《中国药典》要求的前提下，其终端客户大多数为散户或医院，可考虑以外观指标分级黄芪饮片，以保证黄芪饮片外观品相，达到品相好价格优。对于需大量以黄芪饮片为主要原料投料生产的中成药生产企业，为控制中成药原料成本，减少加工过程中有效成分转移率较低等影响因素，可考虑平均最窄方向直径为0.30～0.72 cm的黄芪饮片投料，价格便宜，有效成分且有保障，能保证中成药质量和疗效，符合市场规律。为满足不同客户需求，对于产地直接加工成黄芪饮片的，保证内在成分指标达标的情况下，可根据黄芪药材外观指标加工成不同等级的黄芪饮片。