长足大竹象成虫体表挥发物动态变化研究

刘丽萍，杨瑶君，龙文聪，廖鸿，付春

乐山师范学院生命科学学院，竹类病虫防控与资源开发四川省重点实验室，乐山 614000

昆虫体内释放到体外的信息素在生物个体或群落之间起重要的化学通讯作用，是昆虫交流的化学分子语言。从生竹的毁灭性害虫长足大竹象（Cyrtotrachelus buquetiGuer）寡食丛生竹笋，一年发生一代，每年在地下生活发育时间长达11 个月，其成虫单个不同时间在不同地点出土，出土后是如何寻找同伴和配偶的？又是如何聚集到竹笋上取食交配产卵的？同年不同季节、同天不同时辰的交配、取食、产卵是如何同步的？由此推测成虫出土后体表挥发性信号物质及其周期性变化在其取食、交配、产卵过程中起着十分重要的作用。

有关昆虫体表信息素的报道较多。鞘翅目昆虫小蠹科(Scolytidae)、天牛科(Cerambycidae)及金龟子类等昆虫体表信息化学物质的分离、鉴定等研究较多[1-7]。目前已鉴定出约20 种金龟子的信息化学物质[8]；天牛雌雄成虫均可释放性信息素，如葡萄虎天牛Xylotrechus pyrrhoderu与家天牛Hylotrupes bajulu[9-11]，人工合成的小蠹信息素和寄主信息化学物质已被应用于小蠹类害虫的防治中，利用寄主植物信息化学物质制备的红脂大小蠹Dendroctonus valensLeConte引诱剂(RTB lure)已经商品化并得到广泛应用[12-14]。迄今为止，昆虫体表信息化学物质已应用于害虫生物防治中。

目前对长足大竹象生物学特征和化学防治方法两个方面的研究较多[15-25]。在长足大竹象信息素研究方面，杨桦等（2010）研究了雌雄虫释放的性信息素的引诱作用[23]。忙定泽等（2012）验证了长足大竹象雌虫存在引诱雄虫的化学信息素并分析了雌虫体表提取化合物的成分[26]。关于长足大竹象体表挥发物质的动态变化尚未见报道。

本研究采用气相-质谱联用分析技术，主要研究以下3 个问题：1）鉴定长足大竹象成虫体表挥发物的成分，确定其相对含量；2）分析长足大竹象成虫体表挥发物的日变化及旬变化，探讨其变化规律；3)分析长足大竹象雌雄个体信息交流的关键挥发物及其变化特点。以期为利用体表信息物质控制长足大竹象种群数量提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

实验所用虫源皆采自乐山市市中区棉竹镇，在8月长足大竹象交配高峰期选择健壮活性强的雌雄成虫，参照杨瑶君等（2010）[20]在温度25 ℃、相对湿度75%、光周期12L∶12D 下用新鲜竹笋室内饲养，每2 d 更换1 次竹笋，待实验检测分析备用。

1.2 主要仪器

Agilent 7890B-5977A GCMS、HP-5MS 毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、Agilent 7697A 顶空进样仪（美国安捷伦公司生产）等。

1.3 挥发物分析

选择具有品种典型特征的长足大竹象成虫在气相色谱-质谱联用仪上进样，将饥饿培养12h 后的长足大竹象放置于进样瓶中静置2h，采用顶空采样法对长足大竹象雌雄成虫体表挥发物成分进行收集并分析。GC-MS 升温程序为起始温度60 ℃，保持1 min，一阶以5 ℃/min 升温至110 ℃，保持10 min；二阶以15 ℃/min 升温至260 ℃，保持2 min。电离方式EI，电离能量70 eV，离子源温度230 ℃，质量扫描范围为30～350 amu。参照忙定泽等的方法，活性成分的鉴定根据联机的Nist14 数据库检索并结合质谱图中分子离子峰和碎片离子峰来定性确定其挥发物成分，运用峰面积归一化法，求得各组分相对含量。

1.4 挥发物的日变化及旬变化测定

8月份是长足大竹象种群密度的高峰期和取食、交配、产卵的主要季节，因此选定8月测定长足大竹象体表挥发物的日变化，根据长足大竹象的日活动规律，每一天测定5 个时间段，分别为9:00-11:00，11:00-13:00，13:00-15:00，15:00-17:00，17:00-19:00，分别统计每个时间段内长足大竹象体表挥发物的种类及相对含量，重复3 次，以算术平均值进行统分分析，对比分析主要挥发物的种类及相对含量的日变化规律。分别统计上、中、下旬长足大竹象体表挥发物的成分及相对含量，对比分析主要挥发物的种类及相对含量的旬变化规律；

2 结果与分析

2.1 体表挥发物的主要成分及含量

通过GC-MS 分析，获得了长足大竹象体表挥发物的总离子流图（见图1）。雌、雄虫挥发物成分及含量随时间的变化呈现不同的变化规律，雌虫挥发物峰值在保留时间3.944 min 出现最高峰（见图1-A）、雄虫在21.022 min 出现最高峰，次高峰出现于2.515 min（见图1-B）。

通过谱库检索总共鉴定出长足大竹象体表挥发物28 种（见表1），其中醛类8 种、烃类7 种、胺类4 种、醇类3 种、酸类2 种、酯类1 种。这些物质随时间的变化规律各不相同。雌、雄虫相同的挥发物共18 种，分别是二甲基硅烷双醇、已醛、正庚醛、对羟基甲基苯甲醛、苯酚、2-甲基哌嗪，棕榈酸丁酯、顺-9-二十三烯。其中含量最高的为苯酚，在8月上旬雌虫体表相对含量高达72.62%，其后依次是顺-9-二十三烯、已醛、对羟基甲基苯甲醛、壬醛等。此外雌虫特有的成分相对含量高至低分别为二十一烷、反-2，4-壬二烯醛、2-氨基-5-甲基己烷、乙基己醛、二甲胺5 种物质；雄虫特有的成分相对含量高至低分别为对羟基苯甲醛、环丙基甲醇、NEthylcathinone、莨菪碱、N-甲基乙醇胺5 种物质。

2.2 体表挥发物日、旬变化

2.2.1 雌虫体表挥发物成分及其相对含量日变化

雌虫8月不同时段主要挥发物种类及数量见表2，由表2 可知，8月上、中、下旬不同时间段成虫体表挥发物质种类和数量明显不同，种类主要有醛、烃、醇、酯、酸及胺等6 大类，其中种类数量最多的是醛类52 种，其次是烃类42 种。醛类物质除8月上旬11—13 时未检测到外，其余时段均检测到；烃类物质各检测时段均出现；酯类从8月中旬开始每个检测时段均出现；酸类、胺类等均从8月中旬开始出现，8月上旬仅检测到醛、烃类和1 种醇类。由此推测雌虫体表信息物质成分应当是醛类、烃类。所检测到的挥发物种类：8月上旬15—17时、17—19 时最多，中旬9—11 时最多，下旬各时段均为11～13 种且差异不大。即8月中下旬挥发物种类逐渐增多，体内分泌物质增多，生命活动也日益增强，此时间段可能是产卵的高峰期。8月中下旬9—11 时是雌虫体表挥发物最多、醛类和烃类也最多，意味着9—11 时可能雌虫一天活动的高峰期。

图1 长足大竹象雌虫（A）、雄虫（B）挥发成分的总离子流图Fig.1 Total ion current spectrum of volatile constituents in female (A) and male (B) C. bugueti

醛类物质和酯类物质集中在9—13 时和17—19时出现，其余醇类物质和酸类物质出现的时间较为随机，其他不同类型的挥发物也都集中在9—11 时之间出现；8月下旬，雌虫主要挥发物种类主要有醛、烃、醇以及胺四类挥发物，醛类物质最多，胺类物质最少，其中在整个检测阶段都有出现的物质为醛类和烃类，醛类在9—13 时出现的种类最多，其次胺类物质主要集中在13—15 时出现，醇类物质集中出现在13—15 时。综合上述分析，挥发物质持续时间最长、种类最多的是醛类与烃类物质，在每个时间段且每天都有出现。虽然烷类、酚类以及烯类型物质分泌的种类并不多，但是在长足大竹象的挥发物中，苯酚、二十一烷以及顺-9-二十三烯的含量相当高。

8月上旬挥发物中相对含量随时间变化明显的是顺-9-二十三烯、二十烷和二十一烷三种物质，如图3所示，二十一烷在体表挥发物中的总含量逐渐下降；顺-9-二十三烯在11—13 时出现了最高峰之后，相对含量随着时间推移也在逐渐降低；而二十一烷的相对含量是随着时间的推移先下降再上升，最低峰和最高峰分别出经GC-MS 分析，雌虫体表挥发物总离子流图中的最高峰基本都出现在19.83 min，对应物质为二十一烷；其后依次为对应的顺-9-二十三烯（保留时间20.88 min）、苯酚（保留时间5.42 min）、苯乙醛（保留时间6.82 min）(见图2）。

总体看来，在11—13 时，15—17 时的三种物质当中二十一烷的相对含量在总挥发物中最高，达到53.2%（见图3-A）；8月中旬主要挥发物变化趋势较为明显的是顺-9-二十三烯、二十烷、二十一烷、棕榈酸丁酯以及壬醛五种物质，挥发物的相对含量随时间的变化见图3-B 所示，其中相对含量一直保持在较高水平的是顺-9-二十三烯和二十一烷两种物

质；其他3 种物质的相对含量较低变化幅度较小；8月下旬变化趋势较为明显的是顺-9-二十三烯、二十一烷、苯乙醛和壬醛四种物质，挥发物的相对含量随时间的变化较大的物质见图7，由图3 可以看出二十一烷的相对含量一直保持在较高水平，在整个检测过程中相对含量最高的时候集中于11—13 时，相对含量高达46%；变化趋势与之相似的还有壬醛，该物质在整个检测过程中也出现了两个峰，最高峰同样位于11—13 时，相对含量为18.0%；苯乙醛变化较平缓，相对含量在15%上下，仅仅在17—19 时出现最低值5.9%；顺-9-二十三烯相对含量变化趋势也较平缓（见图3-C）。顺-9-二十三烯常被用于制作

昆虫性引诱剂，而八月上中旬正是长足大竹象虫交配的旺季，雌虫通过大量分泌顺-9-二十三烯吸引雄虫找到雌虫交配，直至八月下旬，产卵后的雌虫寿命将至，各项功能衰退，使得体内顺-9-二十三烯、苯酚、二十一烷等物质分泌减少。

表1 长足大竹象雌雄成虫体表挥发物相对含量Tab.1 Relative content of volatiles on body surface of male and female C. buqueti

表2 8月雌虫挥发物种类变化Tab.2 Variation of body surface volatiles in female C. buqueti in August

图2 雌虫挥发物总离子流图Fig.2 Total ion current spectrum of surface volatiles in female C. bugueti

图3 长足大竹象雌虫主要挥发物质相对含量的日动态变化Fig.3 Daily dynamic change of the relative content of main surface volatile substances in female C.buqueti

2.2.2 雄虫挥发物成分及相对含量8月日变化规律

同上8月上旬处于交配前期，雄虫较中下旬更为活跃，此阶段采用上午9 时到晚上20 时每隔两小时对雄虫体表挥发物进行检测。结果表明，雄虫最高峰随时间的变化存在一定差异，但大都出现在保留时间为19.83 min 的物质，对应物质为二十一烷；其次为保留时间12.76 min 所对应的4-羟基-苯甲醛，5.42 min 所对应的苯酚。8月上旬醛类、烃类、醇类、酯类以及酸类物质在检测的9:00—21:00 都一直存在；其他类型如胺类、物质集中在上午9—13 时和下午15—19 时出现，不同类型的化合物，共同点是13—15 时以及17—19时出现种类最多，频率最高；8月中旬挥发物种类变化规律为烃类、醛类以及酯类物质在检测的9 时到19 时都一直存在；酸类物质在15—17 时未出现，除此之外胺类物质仅仅在17 时出现了1 次，远低于上旬胺类物质出现的频率；其他不同类型的挥发物在相同时间段内的出现频率略高于上旬；8月下旬挥发物种类变化规律为在检测的5 个时间段都出现的有醛类、烃类、醇类和酸类物质；除此之外胺类物质仅在13—15 时出现；酯类物质在9—11 时和13—15 时有出现；其他不同类型的物质在11—13 时出现的频率最高。综合上中下旬的变化得出，醛类、烃类及醇类物质在每个时间段且每天都有出现（见表3）。

表3 8月雄虫挥发物种类变化Tab.3 Variation of surface volatiles of male C. buqueti in August

雄虫在8月上旬相对含量随时间变化明显的主要有醛，醇以及烃类物质，分别是二甲基硅烷双醇、苯乙醛、壬醛、十九烷、顺-9-二十三烯以及二十烷共6 种物质，具体随时间的变化趋势如图2-9所示，其中壬醛、顺-9-二十三烯和二十烷三种物质具有相同的变化趋势，在检测过程中相对含量的变化呈现双峰模式，其中最高峰均出现正在下午15—17 时；而二甲基硅烷双醇和苯乙醛的变化相对平缓无太大起伏，且相对含量也较低；十九烷的变化情况不同于其他几种物质，该物质在17—19 时相对含量突然降低出现了最低峰（见图4-A）；8月中旬雄虫体表挥发物随时间变化较大有4 种物质，分别是十九烷、棕榈酸丁酯、顺-9-二十三烯和二十烷四种物质；其中在检测过程中相对含量一直保持在较高水平的是十九烷和顺-9-二十三烯，相对含量最高时分别达到了55%和40%。顺-9-二十三烯、二十烷和十九烷三种物质的大致变化趋势相类似，检测过程中相对含最低的点都出现在11—13 时，相对含量最高的点出现在15—17时；而棕榈酸丁酯的变化趋势刚好与该三种物质相反，相对含量最低时出现在下午15—17 时，相对含量最高值出现在11—13 时（见图4-B）；8月下旬雄虫体表挥发物随时间变化较大的物质主要有苯乙醛、壬醛和十九烷三种物质，总体来看相对含量较高的为壬醛。其中壬醛和十九烷变化趋势相同，相对含量随时间的推移均是先下降后上升，在15—17 时出现相对含量最低的点；苯乙醛的变化趋势不同于其他两种物质，在检测过程中该物质的相对含量随时间的推移先上升后下降，同样在15—17 时出现最低值（见图4-C）。

图4 雄虫主要挥发物质相对含量的日动态变化Fig.4 Daily dynamic change of the relative content of main surface volatile substances in male C. buqueti

2.3 长足大竹象体表挥发物成分及相对含量旬变化规律

2.3.1 体表挥发物主要成分及相对含量

GC-MS 分析8月上、中、下旬雌雄虫体表挥发物成分，得到雌虫挥发物共23 种，雄虫挥发物共23 种，其中苯乙醛、壬醛、棕榈酸丁酯、顺-9-二十三烯以及二十烷这5 种物质在雌虫和雄虫体表挥发物中均有检测到。除以上5 种物质之外已醛、正庚醛、二十一烷3 种有机物在雌虫整个检测周期当中也很活跃。其相对含量随时间的变化如图5-A 所示，由图可以看出二十一烷在整个8月份相对含量的平均值都保持在较高水平，最高时为8月上旬约43.1%；平均相对含量最低的为棕榈酸丁酯（仅在8月中旬和下旬检测到少量；其他几种物质的变化情况各不相同。而雄虫体表挥发物测得的成分当中出现频率较高的还包括二甲基硅烷双醇和十九烷这两种物质。雌虫主要挥发物相对含量随时间的变化如图5-B 所示，其中顺-9-二十三烯的相对含量在8月中上旬均保持较高水平，8月下旬突然骤降；除此之外二甲基硅烷双醇的平均相对含量一直较其他物质低许多，而十九烷在8月上旬和8月下旬的相对含量都较高，8月中旬却未能检测到该物质。

图5 雌虫（A）、雄虫（B）体表挥发物主要成分相对含量的旬变化动态Fig.5 Ten-day changes of the relative content of the main content of surface volatiles in female (A) and male (B) C. buqueti

2.3.2 体表挥发物种类旬变化规律

长足大竹象体表挥发物共有28 种，其中醛类物质8 种，烃类物质7 种胺类物质4 种，醇类物质3 种，酸类和酯类物质分别为2 种和1 种，除此之外还有4 种其他不同类型物质。这些物质随时间的变化规律各不相同，具体变化情况见图6。整个检测过程中醛类物质种类较多，雌虫8月中旬醛类物质最多，雄虫体表挥发物中的醛类则在8月上旬最为丰富；烃类物质也比较丰富，随着时间的推移烃类物质在8月下旬逐渐减少；除此之外还有胺、醇、酯和酸类物质的变化，其中酯类物质仅棕榈酸丁酯一种（见表1）；其他不同种类的物质在雄虫的体表挥发物中的种类在整个8月都要多于雌虫。

图6 长足大竹象体表挥发物种类随时间变化情况Fig.6 Variation of body surface volatiles of C.buqueti with time in August

3 讨论

本实验采用顶空采样法对长足大竹象体表挥发物成分进行检测分析，共测得28 种化合物，其中雄虫23 种，雌虫23 种，共同挥发物18 种，其中苯酚含量最高，其后依次是顺-9-二十三烯、已醛、对羟基甲基苯甲醛、壬醛等。雌虫特有的成分相对含量高至低分别为二十一烷、反-2，4-壬二烯醛、2-氨基-5-甲基己烷、乙基己醛、二甲胺5 种物质。雄虫特有的成分相对含量高至低分别为对羟基苯甲醛、环丙基甲醇、N-Ethylcathinone、莨菪碱、N-甲基乙醇胺5 种物质。在整个八月，主要挥发物质有烃、醛、醇、酯、酸及胺类等，其中，种类最多的是醛类，酚类物质最少。醛类与烃类物质在每个时间段且每天都有出现，持续时间最长、种类最多。

本文研究结果与忙定泽等[26]通过长足大竹象体表粗提液测得的84 种化合物异同。相同点是，雌雄个体体表挥发物成分具有较大相似性，相同的化合物成分多达19 种。雌虫主要挥发物中顺-9-二十三烯、二十一烷这两种物质在整个8月都存在，其中二十一烷的相对含量从上旬到下旬都呈现下降趋势，且日变化基本一致，表现为先升高后降低。与生活习性联系。相关研究表明雄性成虫完成交配后大都会死亡[24]，所以该物质可能是雌虫挥发的引诱物质的组成成分，随着大部分个体都完成交配，雄虫死亡，雌雄个体之间的引诱物质也逐渐减少。顺-9-二十三烯的相对含量在一天中最高峰分别位于9—11 时和15—17 时。雄虫体表挥发物十九烷在整个8月都存在，从上旬到中旬相对含量增加，下旬相对含量减少。杨瑶君等[17]在对长足大竹象生活习性的研究中表明，成虫一天中的出土时间为早晨6—10 时，下午16—19 时，主要活动时间9—19时，由此可以推测该物质可能为起到个体间信息交流的作用，在主要活动时间内该物质的相对含量一直保持较高水平。研究表明长足大竹象成虫对雌、雄成虫体表挥发物质的行为反应的实验中，雌虫体表挥发物对雄虫有较强引诱作用，但具体的化学成分没有确定[23]；忙定泽等[26]在长足大竹象雌雄成虫风洞行为反应的测试中，以雌成虫作为诱引源时，显示了较强的引诱活性，进一步证明长足大竹象体挥发物中的某些成分在个体之间的信息交流之间发挥着重要作用。但在忙定泽等的实验中并没有对体表挥发物成分进行分析鉴定，而是采用溶剂浸提法对体表信息化学物质进行采集分析，未能明确长足大竹象成虫体表挥发物的成分，及其相对含量及物质种类随时间变化的规律。本实验在长足大竹象危害竹林的高峰期8月对其进行采集，利用顶空采样法检测竹象虫体表挥发物的动态变化规律，结果表明雌雄体表体表挥发物成分大致相同，主要为醛类和烃类物质。杨瑶君等[20]通过GC-MS 对竹笋挥发物进行分析后发现其中含有苯酚，说明苯酚在对雄虫的引诱中所起的重要作用。本实验在长足大竹象雄性成虫中检测到苯酚的存在，该结果进一步证明雌雄个体之间存在相互引诱的信息。

信息素是昆虫与昆虫之间相互交流的主要物质，通过昆虫信息素诱捕昆虫从而达到昆虫防控的目的不仅对环境无污染且人工成本低、诱捕效果显著。本文通过对长足大竹象的体表挥发物的动态变化的研究，为长足大竹象的化学信息素的开发利用提供了技术支持以及理论基础。但有关其信息素的成分、比例、分泌性信息素的腺体及其部位等，还有待进一步研究。