液体样品对核磁图谱质量影响因素探讨

崔 洁，向俊锋,2

(1.中国科学院 化学研究所，北京 100190； 2.中国科学院大学，北京 100049)

核磁共振技术以其可对样品实现无损检测、全面的信息量、丰富的技术手段结合现代飞速发展的计算机系统成为了其他技术无法比拟的强大工具[1].近年来，核磁共振波谱仪在国内得到了极大的普及，已经成为科研工作者进行化合物结构表征及动力学性能研究的首选仪器.核磁共振谱进行结构鉴定、动力学研究及构象分析时非常方便，尤其是现代的谱仪操作便捷性提高，通过自动程序几分钟即可测得一张氢谱，可在很大程度上缩短样品分析时间[2].

在实际测试工作中，需要得到分辨率高、信噪比好、出峰位置明确且裂分清晰的谱图[3-4].目前的核磁共振谱主要存在峰型不对称、半峰宽大、灵敏度低和谱峰无法解释等问题[5-6]，得到一张满意的谱图比较困难，因此研究谱图的影响因素非常有必要.谱图数据的影响因素最主要有两个方面：仪器状态和样品的配制，在最优的仪器状态下，样品的配制成为影响谱图效果的关键因素.本文将从样品制备的各个环节(核磁管的选择、氘代试剂的选取、样品制备和pH等方面)展开讨论，最终提出样品测试的最优条件，为其它样品核磁共振谱测试提供借鉴指导.

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

瑞士Bruker AVANCE Neo 600(配备了5 mm PATBO Z-GRD探头)和Bruker AVANCE 500WB(配备了5 mm PABBO Z-GRD探头)型高分辨液体核磁共振波谱仪.样品均为实际测试的液体样品，主要是由中国科学院化学研究所有机固体实验室提供.氘代试剂来自于美国剑桥CIL、北京伊诺凯科技有限公司、百灵威氘代试剂及北大大北公司.

1.2 测试条件

试验温度控制在298.2 K，样品在磁体中等待5 min以上以达到稳定温度，自动匀场采用(bruker)TOPSHIM程序结合TUNE(Z-X-Y-XZ-YZ-Z)过程匀场，常规的一维1H NMR试验采用标准30 °倾倒角的单脉冲序列(zg30)，化学位移采用溶剂中的内标TMS(δ 0)定标，一维水峰抑制1H NMR试验采用预饱和技术抑制溶剂中水峰(zgpr)，1H化学位移采用水溶剂峰(δ 4.80)定标，脉冲间隔2 s，扫描次数16次，数据点数32 k或64 k，线宽因子0.3 Hz.

2 结果与讨论

2.1 核磁管的选择

为了确保测试结果的准确度，核磁管应择优使用.核磁管的选择主要涉及几个方面：同心度、凸度、管体材质/管体表面光洁度及核磁管类型[7].在本研究当中，重点讨论了核磁管管体内外表面光洁度和核磁管类型对核磁测试结果的影响.

2.1.1 核磁管管体内外表面光洁度

在配置样品或者存放过程中，核磁管很容易被污染，在放入磁体前应擦干净管体外表面，以避免试剂及杂质干扰谱图甚至污染核磁探头.核磁管管体内外表面光洁度对核磁测试结果的影响如图1所示.

由图1可见，图1(b)核磁管表面光洁度明显优于图1(a)，且图1(a)谱峰宽化，峰型严重变形(匀场程序也不能改善)，而图1(b)中谱峰都是很尖的峰，这是因为NMR需要具有精度非常高的均匀磁场，核磁管表面轻微的破损都能改变样品检测区域磁力线的分布，破坏基础的均匀磁场，引起信号展宽甚至畸变.

图1 相同样品、不同核磁管的氢谱Fig.1 1H NMR spectra of sample using different nuclear magnetic tubes

2.1.2 核磁管类型

常用的核磁管类型主要有压力阀门核磁管、螺纹口核磁管、厚壁核磁管、同轴核磁管、高温核磁管及微量核磁管等[8].正确选择核磁管可以最大限度的降低样品区域磁化率的差异，以确保测试样品处于均匀磁场中，从而得到最准确的试验数据.核磁管类型对核磁测试结果的影响如图2所示.

图2 同一样品在常规核磁管(a)和升温核磁管(b)中的1H NMR谱图(353.2 K ,500 M)Fig.2 1H NMR spectra of sample using a normal tube (a) and a tube under high temperature conditions(b)

由图2可见，在高温条件下(353.2 K)，使用常规型核磁管得到的谱图峰型畸变，相比之下，升温核磁管中得到分辨率有很大提高的谱峰，这是由于后者所用的材质具有更强的抗热变形能力，保证了升温过程中样品磁场的均匀性，而常规型核磁管的各项参数在剧烈温度变化中发生了不同程度的改变，破坏了原有的均匀磁场.

2.2 氘代试剂的选择

氘代试剂中的氘可提供场频锁定信号，且可避免质子谱中溶剂信号太强[9].配制核磁样品时，通常情况下，充分提纯干燥的样品都是溶解在氘代试剂中.氘代试剂有很多种，在选择氘代试剂时需要考虑的因素包括：(1)样品在氘代试剂中的溶解度.(2)氘代试剂的粘度.(3)氘代试剂的熔点和沸点.(4)氘代试剂中含活泼氢.(5)避免氘代试剂与测试样品发生反应.(6)不同来源氘代试剂.(7)氘代试剂中的水.在本研究当中，重点讨论了(5)、(6)和(7)对核磁测试结果的影响.

2.2.1 避免氘代试剂与测试样品发生反应

当选择的氘代试剂与测试样品发生反应后，会使得谱图复杂化，无法得出真实的样品结构信息[10].更换不同的氘代试剂后可能会得到不同的谱图，从而加大了谱图解析难度.在选择氘代试剂时应充分考虑样品的性质，避开可能会与样品发生反应的氘代试剂.

如图3所示，图3(a)为图中化合物在CDCl3中的氢谱，氢谱缺少了1,3-二硫杂环戊烯位置的氢.考虑到溶剂的影响因素，更换CD2Cl2，得到图3(b)，观察到6.5 ppm处出现了新峰，谱图的化学位移及积分面积均与结构一致.放大CDCl3中图可见此处也有峰，但是面积不对，说明在CDCl3溶剂中分子结构发生了改变，因此推测该氢与CDCl3溶剂中的活泼D发生了交换，导致谱峰强度变弱，甚至消失，而CDCl3中的活泼D来自于其光解产物.

图3 样品分别溶解在CDCl3(a)和CD2Cl2(b)中得到的1H NMRFig.3 1H NMR spectra of sample dissolved in CDCl3 (a) and CD2Cl2(b)

2.2.2 不同来源氘代试剂

除此以外，不同厂家生产的溶剂质量也有差别.对比了来自4家不同经销商的氘代氯仿，在Bruker AVANCE Neo 600核磁谱仪上，采用同样的采样参数及处理参数进行了氢谱测试，结果如图4所示.由图4可见，在0.8～3.0 ppm区域，4家不同经销商的氘代氯仿杂峰情况以及水峰高低具有明显差异.在本对比试验中，购于青岛腾龙微波科技有限公司的CIL(Cambridge isotope laboratories，Inc)氘代试剂(d)的谱图显示其纯度最高，杂质峰甚至可以忽略.

图4 不同生产厂家的CDCl3的1H NMR对比Fig.4 1H NMR spectra of sample using CDCl3 from different manufacturers

2.2.3 氘代试剂中的水

图5 大瓶装(a)和小支封装(b)的CDCl3中水含量对比Fig.5 Comparison of water content in CDCl3 stored in large bottle (a) and small bottle (b)

几乎所有的氘代试剂都含有少量的水，且由于许多溶剂本身具有一定的吸湿性，储存时间越长，水含量越高.水峰的存在将极大降低核磁谱图的质量，尤其在测试溶解性差的样品氢谱时更为明显[11].因此氘代试剂的储存也是非常重要的方面.如图5所示，大瓶装的氘代试剂与小支装的相比，水峰有着显著的增强，为了降低水峰的影响，建议选择小支封装的氘代试剂.

图6 同一样品不同浓度的1H NMR(500 M)(a)原浓度，(b)稀释三倍Fig.6 1H NMR spectra of sample with different concentrations(a) original concentration, (b) 1/3 of the original concentration

2.3 样品处理

2.3.1 样品量的要求

样品量的要求主要是针对不同的核测试项目进行[12].对于5 mm核磁管，如要测试氢谱，3～10 mg样品足够.对于碳谱和杂核，样品浓度至少为氢谱的5倍(一般在100 mg左右)，但浓度太大会因饱和、粘度增加而降低分辨率.如图6(a)可看出，由于样品的浓度过大造成了谱峰宽化，多重裂分信号融合成一个宽峰，谱峰重叠严重.将该核磁管中的样品稀释三倍后重新进行1H NMR测试，结果如图6(b)示，与之前氢谱相比分辨率有显著提高，共振信号的宽度明显变窄，多重裂分信号清晰可见.因此对于二维试验，为了获得较好的信噪比，样品量要在溶液粘度与灵敏度之间做好平衡.

2.3.2 样品的充分混合

能否在核磁管中溶解样品最主要取决于样品能够混合均匀，未得到充分混合的溶液内部磁化率不同，最终导致谱图分辨率降低[13-14].样品与氘代试剂充分混合，也就是保证溶液中无气泡、无固体悬浮、漂浮、沉淀，得到均一的真溶液，且样品一直保持在核磁管的底部.

同一样品充分溶解前后的1H NMR谱图如图7所示.由图7可看出，样品与溶剂的混合液经过简单物理混合后，由于内部均匀性差，即使匀场仍无法得到均一的磁场，氢谱中的谱峰存在明显不规则裂分，峰型畸变，不是对称的高分辨谱峰，如图7(a)、(b)所示.与图7(c)中充分摇匀的真溶液氢谱对比，半高宽增加了十几倍，这种谱图可能给人错误的结构信息.因此，在配制溶液时应进行多次的摇晃并静置一段时间使之溶解完全再进行测试，消除分子的各向异性并保证样品的均一性.

图7 样品混合对1H NMR结果的影响(a)未充分混合样品的自动匀场谱图，(b)手动匀场谱图，(c)经过充分混合样品的自动匀场谱图Fig.7 Effects of sample mixing on 1H NMR spectra(a) Automatic shimming spectrum of poorly mixed samples, (b) Manual shimming spectrum of poorly mixed samples, (c) Automatic shimming spectrum of fully mixed samples

2.4 pH值

pH值对于活泼氢的出峰影响很大，常见的活泼氢是与氧、氮和硫共价相连的氢原子,因存在着快速交换或四极矩弛豫机制, pH值有显著的作用[15].如图8所示，在不同的溶液环境下得到15N部分标记的NH4Cl的氢谱，在不恰当的pH溶液中，丢失很多有用的NH积分面积、耦合裂分等信息.当pH为弱酸性时，谱峰分辨率提高，可以同时观察到14N和15N对活泼氢的裂分.

图8 溶液的pH值对于活泼氢出峰的影响(a)D2O∶H2O=1∶9溶液，(b)加入1%体积比的氘代DMSO，(c)加入1%硫酸Fig.8 Effect of pH value of solution on peak of active hydrogen(a) D2O∶H2O=1∶9 solution, (b) adding 1% volume of deuterium DMSO, (c) adding 1% volume of sulfuric acid

3 结论

在本研究当中，基于液体样品核磁试验结果分析，讨论了几个关键因素对谱图效果的影响：(1)在选择核磁管时，必须保证核磁管管体内外表面足够光洁，且在高温条件下(353.2 K)，优先选用升温核磁管，谱峰分辨率有很大的提高.(2)在选择氘代试剂时，尽量选择小支密封装的氘代试剂，降低水峰的影响，并且应该充分考虑样品的性质，避免试剂与测试样品发生反应.(3)为了获得较好的信噪比，样品量要在溶液粘度与灵敏度之间做好平衡，样品必须与溶剂充分混合均匀.(4)pH值主要是对于与氧、氮和硫共价相连的氢原子影响明显，为提高谱峰分辨率，应该选择恰当的pH溶液.

致谢：感谢中国科学院化学研究所王巍工程师为本研究工作提供的支持.