冰水混合物保存绒山羊液态精液试验初报

赵艳娇，李丰田

（辽宁省现代农业生产基地建设工程中心，辽宁 辽阳 111000）

冰水混合物是水的一种特殊状态，其内部温度为0℃，融化成水时需要吸收大量热量变成同温度的水，再吸收热量使水的温度升高，比0℃水吸收的热量高；反之，在其转化成冰的过程中，首先需要释放出大量的热才能转化为同温度的冰，然后再释放热量使冰的温度继续降低。冰水混合物向两个方向转化的过程中存在二次吸热或放热，其温度才能够比其他状态时更为稳定。利用这一规律开展了冰水混合物保存绒山羊液态精液的试验，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲养管理

选用辽宁绒山羊成年公羊3只，采集精液，经检测合格后制成混合精液。根据《辽宁绒山羊饲养管理技术规范（Y／T2893—2016）》，在采精前1个月增强公羊的运动，每天运动2次，每次2～3 km／h，饲料精粗比调整到3∶7，日粮中粗蛋白水平保持在16%。采精期间加喂鸡蛋2个、胡萝卜0.4 kg，每天采精1～2次［1］。

1.2 试验器材

恒温水浴锅1台、酒精温度计5支、羊用假阴道3套、双联球1个、调温冰箱1台、500 mL烧杯2个、200 mL烧杯4个、低温保存柜1台，200～600倍带恒温板的光学显微镜1台等。

1.3 试验分组

以4～5℃水保存精液为对照组，以0℃冰水混合物保存精液为试验组。正式试验前对所有公羊进行为期20 d的排精操作，排除死精子以提高精子活力，每周排精3～4次。3只公羊精液全部达到合格标准（活力≥60%）时开始正式试验。每次试验3只公羊的精液均达到合格标准后进行混合，以消除公羊个体之间的差异。精液共成功采集3次，每组每次检测15份，试验组和对照组分别检测45份精液。

1.4 保温介质的制备

1.4.1 4～5℃水的制备 将冰箱温度调整到4～5℃，再用500 mL烧杯盛装300 mL水放入冰箱中降温，直到水温稳定在4～5℃，备用。

1.4.2 0℃冰水混合物的制备 使用干净塑料袋装入300 mL水，系严袋口（不漏水）；放入调温后的冰箱冷冻区内，冷冻区的制冷温度调到－5℃；待塑料袋中的水一半冻成冰时取出，将冰压碎，与同温度的水放入烧杯中，再放入冰箱0℃保鲜区，放入酒精温度计，直至冰水混合物的温度为0℃，备用。

1.5 精液稀释

精液采集后立即进行等温稀释（33℃）。精液稀释液配方：葡萄糖3.0 g，柠檬酸钠3.0 g，卵黄20 mL，双蒸水100mL。取精液稀释液80mL，加青霉素1×105IU、链霉素1×105IU［1］。

1.6 精液降温保存

将稀释后的精液从集精杯内移入同温度的试管内，放入33℃的150 mL温水中，再放入0℃冰箱中继续降温，当水与精液的温度都达到0℃时，再放入150 mL 0℃冰水混合物中。

1.7 测定项目及方法

原精稀释后检查精子的活动状态，测定指标包括精子活力、畸形率、存活时间。采用全自动精子分析系统检测精子活力、畸形率；精子存活时间是指精子处于低温状态时的存活时间，至全部死亡为止。

将0℃冰水混合物保存和4～5℃水保存精液分别放置在0℃、4～5℃低温保存柜中进行镜检，去掉显微镜恒温板，观察精子的活动状态。

1.8 数据的统计分析

组间数据采用t检验法进行检验。

2 结果与分析

2.1 精子活动状态观察

0℃冰水混合物保存的精液在0℃恒温保存柜中镜检（显微镜、盖玻片、载玻片提前预冷至0℃），精子全部处于静止状态。4～5℃保存的精液在4～5℃低温柜中镜检发现，仍有一部分精子在慢速蠕动。说明4～5℃条件下精子仍在消耗能量；0℃条件下精子处于完全休眠状态，不消耗能量。

2.2 精液参数指标

结果见表1。

从表1可以看出，试验组与对照组的精子畸形率无显著差异，试验组低温存活时间显著高于对照组。说明0℃冰水混合物保存绒山羊液态精液的效果好于4～5℃保存。

表1 0℃冰水混合物保存和4～5℃水保存的精液参数指标测定结果

3 结论与讨论

1）精液稀释后低温保存，低温环境能够降低精子的新陈代谢［2］，减少精子的能量消耗，从而延长精子的存活时间。从本试验结果来看，在0℃条件下精子运动才完全停止；而4～5℃条件下精子有微弱的运动，仍在消耗一定的能量，进行着新陈代谢。这可能是0℃条件下精子存活时间高于4～5℃的原因之一。

2）以水作为保存精液的介质时，0℃冰水混合物的吸热和放热缓冲范围大，导致温度变化幅度小，温度变化所需要的时间更长，从而使保存精液的温度更加具有稳定性和安全性，这可能是0℃保存精子存活时间高于4～5℃的原因之二。

3）由于试验时间和试验条件的限制，本试验仍有很多内容没有开展，如在0℃冰、0℃水及其他吸放热数值较大的介质中保存等，从而决定了本试验不具有系统性，只是系统试验的一个组成部分，起到抛砖引玉的作用，需在以后进一步开展相关试验研究。

4）0℃冰水混合物制作简单，成本低廉，精液保存效果好，安全系数高，可在精液运输、保存时采用。