水牛NLRP5基因原核表达载体构建及多克隆抗体制备

陈东荣，肖 凯，段林伟，张 明

（广西大学 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室／动物繁殖研究所，南宁 530004）

NLRP5［pyrin domain（PYD）containing proteins 5］基因是胚胎需要的母体抗原，也称为Mater（maternal antigen that embryos require），是在哺乳动物中最早被鉴定的母源效应基因之一［1］。NLRP5属于NLRP（nucleotide－binding oligomerization domain，leucine rich repeat and pyrin domain containing proteins）蛋白家族。人类有14 种NLRP成员，分别为NLRP1～NLRP14，在小鼠中已报道有20个NLRP成员蛋白［2－3］。NLRP家族成员包括三个结构域定义，分别是PYD、NACHT、LRR结构域。N末端区域为PYD结构域，主要参与炎症和细胞凋亡；LRR结构域调节不同细胞功能的蛋白质－蛋白质相互作用；猜测NACHT结构域可与ATP／鸟苷三磷酸结合［2］。NLRP家族基因可以分为免疫相关基因和生殖相关基因，免疫相关基因包括NLRP1、NLRP3、NLRP6、NLRP10 和NLRP12，其他的NLRP是生殖相关基因［3］。敲除Nlrp5基因后，小鼠的早期胚胎阻滞在2细胞期，表明Nlrp5在早期胚胎发育过程中起着至关重要的作用［1］。在猪卵母细胞中显微注射dsRNA干扰NLRP5，胚胎停滞在2～8细胞阶段［4］；沉默猕猴的NLRP5基因，早期胚胎也阻滞在8～16细胞期［5－6］。此外，NLRP5、FILIA、OOEP（FLOPED）、PADI6和TLE6被确认为皮质下母源效应复合物（SCMC），是位于卵母细胞和胚胎皮层下的一种多蛋白复合物，对胚胎发生至关重要［7－8］。与NLRP5蛋白同家族的NLRP2和NLRP7有可能是皮质下母源效应复合物的成员［9－10］。上述研究表明NLRP5是动物卵母细胞和早期胚胎发育的相关基因。

关于水牛NLRP5基因的研究较少，此外，生物制品市场上缺乏水牛母源基因抗体商品，难以对它们的功能和定位等机制进行深入研究。本试验以水牛为研究对象，克隆水牛NLRP5基因序列，进行生物信息学分析，并通过构建水牛NLRP5原核表达载体对NLRP5蛋白的表达条件进行优化，然后进行纯化，制备多克隆抗体，用Western blot分析该基因在水牛各组织的表达特性，为研究水牛NLRP5在水牛生殖过程中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 水牛组织、质粒与试验动物

水牛卵巢、心脏和肝脏等组织，取自南宁市肉联厂屠宰分厂。原核表达载体pET－32a（＋）质粒，广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室保存并提供。感受态细胞5α和BL21（DE3），购自北京全式金生物技术有限公司。4周龄昆明小白鼠，购自广西医科大学实验动物中心。

1.2 主要试剂

2×Rapid Taq Master Mix、2×Phanta Max Master Mix和胶回收试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；反转录试剂盒、pMD18－T载体、限制性内切酶和T4 DNA连接酶，购自宝日医生物技术（北京）有限公司；碱磷酶马抗小鼠标记IgG，购自北京中杉金桥有限公司；预染蛋白Marker，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司和生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 试验步骤

1.3.1 引物设计 根据NCBI公布的水牛NLRP5基因预测序列（XM＿006041797.2），用Oligo7.0软件设计扩增引物。所有引物（见表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 NLRP5基因克隆引物序列

1.3.2 总RNA的提取与cDNA的合成 收集GV期的水牛卵母细胞，直接用微量提取试剂盒提取卵母细胞总RNA。取高温灭菌的研钵置于无菌超净台中，先倒入液氮预冷研钵，待液氮挥发完将水牛各组织样品放研钵中用剪刀剪碎，再加入液氮淹没组织；液氮快挥发完时用研磨棒研磨组织，组织会越来越细，再加入液氮继续研磨。整个过程需添加4～5次液氮研磨，最后将组织研磨成粉末，再盛于预冷的灭菌EP管中。采用TRIzol法提取总RNA，通过分光光度计检测总RNA的浓度和纯度。利用反转录试剂盒将细胞和各组织的RNA反转录成cDNA样品，－80℃保存。

1.3.3 PCR扩增 以反转录后的cDNA为模板，用基因特异性引物进行PCR。反应体系：2×Phanta Max Master Mix 12.5μL，上下游稀释引物各1μL，DNA模板2μL，RNase－FreeH2O8.5μL。PCR扩增程序：第一步预变性95℃5 min；第二步95℃15 s，60℃15 s，72℃30 s，34个循环；第三步72℃5 min。PCR结束后将产物用2×Rapid Taq Master Mix进行72℃20 min加A尾。

扩增且添加A尾的产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，确定目的片段大小。利用胶回收试剂盒回收目的片段，将胶回收产物连接pMD18－T载体，转化5α感受态细胞，涂于氨苄青霉素LB培养基上，37℃培养过夜。挑取单菌落进行PCR扩增鉴定，取阳性菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.3.4 水牛NLRP5基因序列的生物信息学分析用DNAStar软件的SeqMan将测序的4段序列拼接成完整的CDS序列。用Megalign软件将克隆出来的序列与预测序列进行同源性比对，在NCBI上下载其他物种的NLRP5基因进行同源性比对。

1.3.5 原核表达载体的构建 根据克隆出来NLRP5序列，对NLRP5多肽的亲水性、疏水性和线性表位等指标进行分析，选取亲水性和免疫原性较好的480 bp片段进行原核表达。再根据pET－32a（＋）载体图谱，设计分别含有限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点的上、下游引物。引物序列：PET32a－NLRP5，F5′－GGCAAGGGAC－3′，R5′－ATTTaagcttgCGGGACCGGGGCGTCCGGCCACTC－3′。以卵母细胞的cDNA为模板，用带有酶切位点的引物进行PCR扩增，获取原核表达目的片段。连接pMD18－T载体，获得重组质粒pMD18－T－NLRP5，将其双酶切后亚克隆至原核表达载体pET－32 a（＋），PCR鉴定和酶切鉴定后进行测序。

1.3.6 重组蛋白的表达及纯化 将pET－32a－NLRP5重组质粒转化至BL21（DE3）感受态细胞中，37℃220 r／min培养至菌液光密度值（OD600）达0.6左右，加入终浓度分别为0，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mmol／L的IPTG，30℃诱导6 h。取诱导表达产物进行SDS－PAGE电泳分析，以确定目的蛋白所需IPTG最佳浓度诱导。在最佳浓度及30℃条件下分别诱导0，2，4，6，8，10 h，确定目的蛋白最佳诱导时间。用液氮反复冻融法裂解菌体，离心后分别收集上清液与菌体沉淀，进行SDS－PAGE电泳分析，鉴定重组蛋白的表达形式。然后用镍柱纯化包涵体蛋白，将纯化后的重组蛋白复性透析，再用His标签抗体鉴定。

1.3.7 免疫程序及多克隆抗体制备 1）首次免疫：将等体积的重组蛋白与弗氏完全佐剂混合，完全乳化后用注射器注射到小鼠背部皮下，采用多点注射。

2）第14，21，35天用重组蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，背部多点注射加强免疫。

3）第42天，采集小鼠血液，4℃静置2 h，4℃12 000 r／min离心10 min，分装，析出血清，－80℃保存，备用。

1.3.8 鼠抗NLRP5多克隆抗体的鉴定 先用制备的多克隆抗体与重组蛋白进行Western blot，检验抗体效价，再用抗体血清检测水牛NLRP5蛋白在卵母细胞及颗粒细胞的特异性表达情况。取200个GV期的卵母细胞和收集的颗粒细胞进行SDS－PAGE电泳，转PVDF膜和脱脂牛奶封闭后，NLRP5抗体37℃孵育2 h，二抗37℃孵育1 h，最后碱性磷酸酯酶显色，Bio－Rad成像仪曝光分析。

2 结果与分析

2.1 水牛NLRP5基因克隆和生物信息学分析

对以卵母细胞的cDNA为模板设计的4段特异性引物进行RT－PCR扩增，电泳检测条带分别为866，942，764，1 002 bp，与预期片段大小相符，见图1。用DNAStar的SeqMam软件将4段序列拼接成完整的CDS序列，共3 297 bp。首次克隆得到水牛NLRP5基因CDS全长序列，由1 098个氨基酸编码。通过ExPasy在线软件预测出NLRP5蛋白分子质量为121.17 kD，预测等电点为6.78。

选择水牛NLRP5（XM＿006041797.2）及NCBI上公布的绵羊（XM＿027978862.1）、山羊（XM＿018063503.1）、牛（XM＿012537380.1）、野猪（XM＿005664875.3）、小鼠（NM＿011860.3）、猕猴（NM＿001127631.1）、倭黑猩猩（XM＿003809864.2）和智人（NM＿153447.4）等物种的NLRP5基因序列，应用DNAStar MegAlign构建NLRP5序列同源性比对，结果见图2。由结果可见水牛与牛和山羊的基因同源性分别为96.3%和93.9%，最低的同源性也有58.1%，说明物种间具有一定的保守性。

2.2 PET32a－NLRP5表达载体的构建与鉴定结果

PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳得到500 bp的目的条带，与预期大小（480 bp）相符，见图3。用限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ对重组质粒和pET－32a（＋）质粒进行双酶切，回收酶切后的NLRP5目的基因和pET－32a（＋），用T4连接酶16℃连接过夜，获得重组质粒pET－NLRP5。再用HindⅢ和EcoRⅠ酶切重组质粒pET－NLRP5也得到预期的目的条带，结果见图4。测序结果与NCBI预测的NLRP5基因序列一致，表明成功构建了NLRP5原核表达载体pET－NLRP5。

2.3 重组蛋白的诱导表达

电泳结果表明，pET－NLRP5重组蛋白在IPTG终浓度为0.5 mmol／L时表达量最高，表达的融合蛋白为36 kD，见图5。在IPTG诱导浓度为0.5 mmol／L时，在30℃分别诱导0，2，4，6，8，10 h，每管取菌液1 mL进行声波破碎裂解，分别收集上清液和沉淀进行SDS－PAGE电泳。结果表明，pET－NLRP5重组蛋白IPTG诱导在10 h的重组蛋白表达量最高，以包涵体形式表达，见图6。

2.4 NLRP5重组蛋白的Western blot鉴定结果

通过用Ni柱纯化，分别收集洗脱液和纯化的NLRP5重组蛋白，结果见图7。通过电泳结果可以看到纯化后的蛋白条带比未纯化的蛋白杂带少，说明NLRP5重组蛋白纯化效果较好，见图8。用Western blot检验包涵体NLRP5重组蛋白的His标签，结果获得36 kD特异性目的条带，见图9。说明成功纯化获得了NLRP5重组蛋白。

2.5 NLRP5多克隆抗体效价

透析复性的NLRP5重组蛋白在检测纯度和浓度均达到免疫准则后，将NLRP5重组蛋白液体与等量弗氏佐剂乳化免疫昆明小鼠，抗原免疫结束后通过对小鼠进行眼球采血，获取抗体血清。按比例稀释NLRP5抗体血清作为一抗与NLRP5重组蛋白反应，用Western blot检测NLRP5抗体效价。结果表明，在约36 kD处检测到特异性的目的条带，说明成功制备水牛NLRP5多克隆抗体，抗体效价高达1∶64 000，见图10。

2.6 NLRP5在水牛卵母细胞和颗粒的表达

以收集的抗水牛NLRP5多克隆抗体血清1∶4 000稀释作为一抗进行Western blot，检测了NLRP5在水牛不同组织的蛋白质表达情况。结果表明，NLRP5在大脑、心脏、肾脏、肌肉、瘤胃、睾丸、子宫、卵巢和颗粒细胞中均不表达，仅在水牛卵母细胞中表达，蛋白质大小为121 kD，见图11、图12。表明抗水牛NLRP5多克隆抗体制备成功，水牛的NLRP5蛋白特异性良好。

3 讨论

NLRP5基因是NLRP超大蛋白家族中的一种母源效应基因，对该基因的研究主要集中在人类、小鼠、猪和猕猴的卵母细胞和早期胚胎中，其中猕猴的卵巢和睾丸都有NLRP5表达［5－6］。牛的NLRP5蛋白被定位在细胞质中［11］，而小鼠NLRP5位于卵母细胞的线粒体和核仁及紧密的核孔中［12］。

本试验成功克隆得到水牛NLRP5基因CDS的3 297 bp完整序列，水牛与牛、山羊、绵羊和野猪的同 源性 分别 为96.3%、93.9%、89.1% 和75.5%，其中与牛、山羊具有较高的同源性，说明NLRP5蛋白在不同物种间的进化具有一定保守性。然而，由于生物制品市场上缺乏水牛母源基因抗体商品，难以对它们的功能和定位等机制进行深入研究。因此，本试验选取NLRP5基因序列亲水性和免疫原性较好的480 bp作为原核表达的目的片段，采用pET－32a（＋）载体作为原核表达载体，该载体还携带有6×His－tag序列，便于纯化目的蛋白且容易鉴定是否成功表达，可以提高重组蛋白的产量。本试验用His标签鉴定重组蛋白正确表达，并制备了鼠抗NLRP5多克隆抗体，Western blot测出该抗体与重组NLRP5蛋白反应效价高达1∶64 000，且验证了NLRP5蛋白仅在水牛卵母细胞中表达而不在其他组织中表达的特异性。这些结果将为进一步研究母源NLRP5基因在水牛卵母细胞和早期胚胎发育中的功能奠定基础。

4 结论

本试验成功克隆了水牛NLRP5基因，构建了pET－NLRP5表达载体，成功制备了鼠抗NLRP5多克隆抗体，且与NLRP5重组蛋白具有良好反应，并验证了该蛋白仅在水牛卵母细胞中特异性表达。