谷氨酰胺转氨酶对白姑鱼鱼糜蛋白-油脂复合凝胶特性及微观结构的影响

周绪霞 陈 红 陈小草 顾赛麒 姜 珊 丁玉庭

（浙江工业大学 食品科学与工程学院 杭州310014）

鱼糜制品是将鱼糜（生鱼浆）斩拌后，加食盐、辅料等擂溃成黏稠的鱼肉糊， 在成型后加热变成具有弹性的凝胶体。此类制品包括鱼丸、鱼糕和鱼香肠等。 鱼糜制品加工业在水产加工业中占有重要地位。研究表明，添加外源油脂不仅能改善鱼糜制品的滋味和营养特性， 而且脂质通过与鱼糜蛋白的乳化作用来改善鱼糜蛋白凝胶的功能特性[1-2]。本实验室研究人员前期将油茶籽油加入鱼糜中，制得凝胶性能较好的鱼糜蛋白-脂质复合凝胶。谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase，简称TGase）是一种催化酰基转移反应的转移酶，能催化蛋白质-蛋白质、 蛋白质-氨基酸之间发生交联反应形成ε-（γ-谷氨酰）赖氨酸键，从而改变蛋白质的结构和功能性质， 赋予食品蛋白质特有的质构和口感[3]。刘海梅等[4]的研究表明添加TGase 可显著提高鲢鱼糜制品的凝胶强度。康壮丽等[5]在鸡肉糜中添加TG 酶后发现， 酰胺I 带的波峰向高波方向移动，诱导蛋白二级结构的变化，包括β-折叠和β-转角含量显著增加（P＜0.05）以及α-螺旋含量的降低，而β-折叠和β-转角结构是凝胶形成的基础，两者含量的提高有利于良好凝胶结构的形成。添加TG酶有利于增强蛋白质之间的交联，引起α-螺旋内部氢键断开，解螺旋并展开而形成β-折叠和β-转角结构。 将TGase 与油脂复合使用是提高鱼糜产品品质的重要途径， 但目前围绕TGase 对鱼糜制品的研究主要集中在对鱼糜凝胶的影响， 而对鱼糜蛋白-脂质复合凝胶特性的研究及其机制则很少报道。

为此，本文研究TGase 添加量对鱼糜蛋白-脂质复合凝胶特性、水分分布状态、蛋白分子间作用力和微观结构等的影响及其机制， 为进一步改善鱼糜制品凝胶特性， 获得具有优良质构特性的鱼糜制品并提高其商品价值提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷冻鱼糜（白姑鱼鱼糜，等级A），购买于上虞市泰之味食品有限公司。油茶籽油，杭州久晟生物科技有限公司；食盐，购于浙江工业大学超市；三聚磷酸钠、 焦磷酸盐钠和六偏磷酸钠等化学试剂为市售分析纯；谷氨酰胺转氨酶（TGase），购买于泰州市东圣食品科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HR2850 型飞利浦打浆机，珠海经济特区飞利浦家庭电器有限公司；CR21GⅡ高速冷冻离心机，日本日立公司；HH-1 型数显恒温水浴锅，江苏省金坛市江南仪器厂；TA-XT2i 型质构仪，英国Stable Micro System 公司；Q100 型差示扫描量热仪，美国TA 公司；T18 basic 高速分散机， 德国IKA公司；SP-75 紫外可见光分光光度计，上海光谱仪器有限公司。HitachiS-4700（Ⅱ）型扫描电镜，日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 鱼糜凝胶的制备 分别取6 份各100 g 的冷冻鱼糜，4 ℃半解冻后分别切成大约1 cm×1 cm×1 cm 的小块放入打浆机内。 每份加入2%食盐、0.3%复合磷酸盐（三聚磷酸钠∶焦磷酸钠∶六偏磷酸钠=2∶2∶1）、8%油茶籽油、12%水和不同含量的TGase。6 组样品中TGase 的添加量分别为鱼糜质量的0%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%。 混合样品于3 000 r/min 斩拌5 min（整个过程控制斩拌温度在12 ℃以下）后灌入蛋白肠衣内（Φ22 mm），排走气泡，扎紧两端，于4 ℃冰箱中预凝胶4 h，然后置于90 ℃的水浴加热20 min 形成凝胶，随后立即冷却，于4 ℃冰箱中冷藏过夜，分析各项指标。

1.3.2 质构特性（TPA）的测定 将鱼糜凝胶切成φ2 2 mm×20 mm 的圆柱体，在室温下平衡30 min后采用TA-XT2i 质构仪测定凝胶的质构特性。 参数设定如下：探头：P/36R，测前速度：2.00 mm/s，测试速度：1.00 mm/s， 测后速度：2.00 mm/s， 应变：60%，触发模式：自动（力），触发力：5.0 g，每秒200个点。

1.3.3 乳化稳定性的测定 采用Luruena-Martinez 等[6]和汪张贵[7]的方法测定鱼糜的乳化稳定性，并作稍微改动。 称取鱼糜乳化物（W1，g）于50 mL 离心管（W0，g）中，500 g 离心3 min 驱除气泡。然后90 ℃水浴加热20 min，5 000 g 离心15 min，倒出表面皿（W2，g）中的游离液体（脂质和水的混和物），称量离心管和鱼糜的总质量（W3，g）。 将收集到的液体于105 ℃加热16 h 后称量总的质量（W4，g）。每处理组设有3 个重复。通过以下公式计算乳化稳定性：

游离出液体的总质量：TEF=（W0＋W1）-W3；游离出液体的质量分数（%）= TEF/W1×100；游离出脂肪的质量分数（%）=（W4-W2）/TEF×100。

1.3.4 差示扫描量热（DSC）分析 称取20 mg 鱼糜凝胶样品，放入氧化铝坩埚底部密封。首先采用标准品对DSC 设备进行校准，然后再对样品进行测定。 在流速为20～30 mL/min 的氮气气氛保护下，将坩埚放在DSC 设备中进行测定，以密封的空坩埚为对照。测定条件为：起始温度-60 ℃（冰的冻结在该温度下达到平衡）；终止温度为30 ℃；升温速率为10 ℃/min。每个样品重复测定3 次，结果用平均值±标准差表示。

水分分布状态分析： 假设鱼糜凝胶中水的热焓值（ΔH0）与纯水的相同，即334 J/g。 可冻结水（包括自由水和不易流动水）含量可通过样品在0℃附近的焓变（ΔH）计算得出。 可冻结水的百分比（Wfro）=ΔH/ΔH0×100%，其中，ΔH 为鱼糜凝胶DSC测得的吸热峰面积计算的单位质量焓变，J/g；ΔH0为纯水的单位质量焓变，J/g。 非冻结水百分比（Wnf）为总含水量与可冻结水百分比的差值[8]。

1.3.5 蛋白质溶解度的测定 鱼糜凝胶化学作用力的测定参考Gómez-Guillén 等[9]的方法：取鱼糜凝胶样品各2 g， 分别加入10 mL 的0.05 mol/L NaCl（SA）、0.6 mol/L NaCl（SB）、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L 尿素（SC）和0.6 mol/L NaCl+8 mol/L 尿素（SD），混合均匀之后进行均质1 min，于4 ℃条件下静置1 h，然后在10 000 g 的转速条件下离心15 min。 用双缩脲法测定上清液中蛋白质的含量。离子键、氢键和疏水相互作用的贡献表示如下：离子键的贡献=溶解于SB 中的蛋白质含量-SA 中的蛋白质含量； 氢键的贡献=溶解于SC 中的蛋白质含量-SB 中的蛋白质含量；疏水相互作用的贡献=溶解于SD 中的蛋白质含量-SC 中的蛋白质含量。

1.3.6 可利用赖氨酸含量的测定 采用陈斌[10]的方法测定。80 mg 邻苯二甲醛（OPA）试剂溶解于2 mL 95%的乙醇中， 加入50 mL 0.1 mol/L 四硼酸钠缓冲液（pH 9.5），加入5 mL 质量分数20% SDS和0.2 mL β-巯基乙醇，并加水定容至100 mL（上述OPA 试剂需使用前现配并于棕色玻璃瓶中4℃放置）。 取0.5 g 样品溶解于10 mL HCl（0.1 mol/L、pH 1.0）中，并均质30 s。 取1.5 mL 均质液于9 000 r/min 离心15 min 后取0.1 mL 上清液，添加上述OPA 试剂4 mL；混合液反应2 min 后，紫外340 nm 处测定总吸收值（Atot）。 为避免游离氨的干扰，取0.75 mL 上述均质液与0.75 mL 10 g/100 mL 的三氯乙酸（TCA）混合，在室温下保持5 min，于9 000 r/min 离心15 min 后取0.1 mL 上清液，添加4 mL 上述OPA 试剂； 混合液反应2 min，紫外340 nm 测定吸收值（Asn）。 可利用赖氨酸吸收值（Acorr）通过Atot-2Asn 计算得到。 可利用赖氨酸含量（mol/g 样品）通过赖氨酸标准曲线求得，并做3 次平行。

1.3.7 SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）参照贾雅[11]的方法，取3 g 样品加入27 mL 5 g/100 mL SDS 后采用高速分散均质机均质，再于85℃的水浴中保温1 h 来溶解样品中的蛋白质，随后在8 000 r/min 离心20 min 取上清液，并用双缩脲法测定上清液中蛋白质的含量， 将蛋白浓度调成1 mg/mL，用于SDS-PAGE 分析。 电泳样品在5%的浓缩胶上浓缩， 在10%的分离胶上进行电泳分离， 上样量为20 μL， 采用浓缩胶80V 及分离胶120 V 的电压进行电泳。

1.3.8 扫描电镜观察 将制备好的凝胶样品切成5 mm 厚的小块，用2.5%的戊二醛固定24 h，再用0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.2）浸泡清洗15 min，重复3 次， 依次用50%，70%，80%，90%，100%，100%的乙醇脱水，每次10 min，然后用氯仿脱脂1 h，用叔丁醇置换30 min，之后进行冷冻干燥，再用离子溅射仪镀金后，通过扫描电镜进行观察。

采用软件ImageJ 1.50i 及其插件FracLac 2003 August C 对扫描电镜图片进行处理。 按照Dàvila[12]的方法对图片进行阈值化处理及分形维数的计算。 分形维数Df按式（1）、（2）计算：

式中：ε——尺度；Nε——一定尺度下含有目标像素的盒子数；D——直线斜率；Df——分形维数。

1.4 统计分析

采用Excel 2007 对数据进行整理， 用SPSS 19.0 对数据进行方差分析，用Duncan 法进行多重比较（P<0.05 表示差异显著），用Origin 8.0 绘图。

2 结果与分析

2.1 TGase 对鱼糜蛋白-脂质复合凝胶质构特性的影响

由表1 可知，随着TGase 添加量的增加，复合凝胶的硬度、弹性、内聚性、胶黏性、咀嚼性和回复性显著性增加（P<0.05），当添加量达到0.4%时趋于稳定，此后无显著性变化，而黏性随着TGase 的增加则无显著性变化 （P>0.05）。 这主要是因为TGase 能够与鱼糜蛋白之间形成ε-（γ-谷氨酸）赖氨酸二肽的非二硫共价键交联， 从而使得凝胶网络结构增强，凝胶硬度、咀嚼性等增大[13]。 庄玮婧等[14]研究了TGase 添加对鲢鱼鱼丸品质特性的影响， 结果表明添加0.3%的TGase 时凝胶硬度、弹性等最大，能有效改善鱼丸质构特性。Tsujiika 等[15]的研究表明，TGase 能显著促进鱿鱼肌球蛋白重链的交联， 添加TGase 的鱼糜凝胶强度是未添加的10 倍，这与本试验的研究趋势一致。 当TGase添加量为0.4%时， 鱼糜蛋白-脂质复合凝胶特性最好， 此时凝胶硬度和咀嚼性分别提高了51.5%和74.9%。

表1 TGase 对鱼糜蛋白-脂质复合凝胶质构特性的影响Table 1 Effect of TGase on texture profiles of surimi protein-lipids composite gels

2.2 TGase 对鱼糜乳化稳定性的影响

由表2 可知，随着TGase 添加量的增加，鱼糜中游离出来的液体质量分数和油脂质量分数逐渐减小（P<0.05），表明鱼糜的乳化稳定性逐渐增强。当添加量达到0.4%时趋于稳定，此后无显著性变化。 TGase 的添加使得蛋白的交联度增加，凝胶网络结构更加紧密， 水分和油脂以更加细小的状态分布在凝胶网络结构中， 从而使得蛋白质与油脂之间的乳化作用更加明显， 形成了更加稳定的蛋白-油脂乳化体系，外在表现出鱼糜凝胶保水保油性的增加和蒸煮损失的下降。 王顺峰等[16]研究也发现禽胸脯肉的蒸煮损失随TGase 添加量的增加呈逐渐下降的趋势。 因此，TGase 的添加能够显著改善含油鱼糜的乳化稳定性并提高产品得率。

表2 TGase 对鱼糜乳化稳定性的影响Table 2 Effect of TGase on emulsion stability of surimi pastes

2.3 TGase 对鱼糜蛋白-脂质复合凝胶水分分布状态的影响

图1 显示的是不同TGase 添加量的鱼糜蛋白-脂质复合凝胶的DSC 曲线。 由图可知，鱼糜凝胶在-10～10 ℃之间出现了一个吸热峰，表明凝胶中的可冻结水在升温过程中发生焓变， 由此可推测出凝胶中可冻结水和非冻结水的含量 （见表3）。 由表3 可知，随着TGase 添加量的增加，鱼糜凝胶中可冻结水的含量逐渐减少， 而非冻结水的含量逐渐增加，当TGase 添加量达到0.4%后趋于稳定。非冻结水指在测试温度范围内未发生相变，与高分子物质紧密结合的水[8]，本试验中主要指与鱼糜蛋白质结合的水。 非冻结水含量的增加表明与蛋白质紧密结合的水的量增加， 表现为鱼糜复合凝胶的持水性增加。 陈斌等[13]研究发现，添加TG-B 酶的鱼糜凝胶的持水性显著增加（P<0.05）。凝胶持水性的增加是由于TGase 能够与鱼糜蛋白之间形成ε-（γ-谷氨酸）赖氨酸二肽的非二硫共价键交联而形成更加致密的凝胶网状结构， 阻止鱼糜凝胶中水分的迁移和损失。 该研究结果与凝胶质构和鱼糜乳化稳定性的变化趋势一致。

DSC 图谱显示，随着TGase 添加量的增加，鱼糜凝胶吸热峰的峰值逐渐向低温段移动。Lue 等[17]的研究表明， 聚合材料中不易流动水以一定的方向包围着聚合物和非冻结水， 排列成第二或第三水化层，形成类似“笼形”的“聚集体”，在空间允许的情况下， 水分子有形成更多氢键的趋势以形成这种结构。随着TGase 添加量的增加，鱼糜蛋白分子之间的交联程度增加， 有利于蛋白与蛋白及蛋白与水分子之间氢键的形成， 使更多水分子禁锢在蛋白凝胶网络结构中， 不易流动水的流动性减弱，导致冰点降低，吸热峰的峰值向低温区移动[18-19]。

图1 添加不同浓度TGase 的鱼糜蛋白-脂质复合凝胶的DSC 曲线Fig.1 The heat flow of surimi protein-lipids composite gels with different concentration of TGase

表3 TGase 对鱼糜蛋白-脂质复合凝胶水分分布状态的影响Table 3 Effect of TGase on water states of surimi protein-lipids composite gels

2.4 TGase 对鱼糜蛋白-脂质复合凝胶蛋白溶解度的影响

由表4 可知，随TGase 添加量的增加，鱼糜凝胶中离子键的贡献逐渐减小， 氢键和疏水相互作用的贡献逐渐增大（P<0.05）。TGase 能够与鱼糜蛋白之间形成更加致密的凝胶网状结构， 水分和油脂以更加细小的状态分布在鱼糜凝胶网络结构中， 从而使得蛋白质与油脂以及蛋白质与水分之间的接触表面积增大， 有利于形成更多的蛋白包裹油脂的乳化体系结构，由于油脂是疏水性物质，因此鱼糜凝胶中疏水相互作用的贡献增大。 另一方面，外源TGase 通过增加ε-（γ-谷氨酰基）赖氨酸共价键的交联而强化了凝胶网络， 对水的束缚能力提高，使水的有序结构更加稳固，提高了疏水相互作用[13]。 氢键的增加是由于TGase 的添加使更多更小的水分及油脂存在于凝胶网络体系中，有利于水分子之间、 水分子与蛋白之间以及油脂与蛋白之间氢键的形成， 外在表现为乳化稳定性及持水性的增加。 离子键贡献的减小可能是由于疏水相互作用及氢键的增加改变了鱼糜蛋白的空间结构，更多的疏水基团暴露出来，从而改变了鱼糜蛋白的电荷，形成的离子键减少。

表4 TGase 对鱼糜蛋白-脂质复合凝胶蛋白溶解度的影响Table 4 Effect of TGase on soluble protein of surimi protein-lipids composite gels

2.5 TGase 对鱼糜蛋白-脂质复合凝胶中可利用赖氨酸含量的影响

由图2 可知，随着TGase 添加量的增加，鱼糜蛋白-脂质复合凝胶中可利用赖氨酸的含量显著性减小（P<0.05），当TGase 添加量达到0.4%后趋于稳定， 此时鱼糜凝胶蛋白中可利用赖氨酸的含量下降了34.83%。 可利用赖氨酸含量的下降间接反映了ε-（γ-谷氨酰基）赖氨酸共价键交联程度的增加[10]，而形成ε-（γ-谷氨酰基）赖氨酸共价键是提高鱼糜凝胶质构特性、 乳化稳定性及持水性等的重要原因。 因此，当TGase 的添加量达到0.4%时， 鱼糜凝胶蛋白中形成的非二硫共价键（ε-（γ-谷氨酰基）赖氨酸共价键）交联程度最高，此时，鱼糜形成了更加稳定的三维网状结构，鱼糜凝胶呈现出较好的硬度和持水性等。

2.6 鱼糜蛋白-脂质复合凝胶SDS-PAGE 分析

图3 显示的是添加不同含量TGase 的鱼糜蛋白-脂质复合凝胶的SDS-PAGE 图谱，可以看出，随着TGase 添加量的增加， 复合凝胶中肌球蛋白重链（MHC）条带颜色逐渐变浅，肌动蛋白条带的颜色基本没有变化。 当TGase 的含量达到0.4%后，MHC 条带颜色基本不变， 此时TGase 催化的鱼糜蛋白达到了饱和状态，这与尚永彪[20]的研究结果基本一致。 整个过程中肌动蛋白的条带基本没有变化， 说明肌动蛋白没有参与TGase 催化的交联作用。鱼糜凝胶中MHC 条带强度的减弱是因为TGase 使MHC 之间通过ε-（γ-谷氨酰）-赖氨酸键发生共价交联而形成了分子质量更大的肽链， 不易被β-巯基乙醇等离解[21]， 进一步表明TGase 的添加促进了蛋白质-蛋白质之间的交联，有利于形成更稳定的鱼糜凝胶网络结构， 这与可利用赖氨酸的含量显著性减小的研究结果一致。

图2 TGase 添加量对鱼糜蛋白-脂质复合凝胶中可利用赖氨酸含量的影响Fig.2 Effect of adding different concentration of TGase on available lysine of surimi protein-lipids composite gels

2.7 鱼糜蛋白-脂质复合凝胶微观结构

添加不同含量TGase 的鱼糜蛋白-脂质复合凝胶的扫描电镜图（放大500 倍）及其对应的阈值化图见图4， 可以看出， 随着TGase 添加量的增加，凝胶表面变得更加平整。图5 表示的是用盒计数方法对阈值化图计算得出的结果， 从其中斜率可以得出相应的分形维数Df。 分形维数表示的是鱼糜凝胶中蛋白质的聚集程度，分形维数越大，表示蛋白质聚集度越大[11]。 从图5 的结果可以看出，随着TGase 的含量从0%增加到0.5%， 分形维数从2.801 增加到2.857，当TGase 含量添加到0.4%后，Df基本保持不变。这进一步说明了TGase 能够与鱼糜蛋白之间形成ε-（γ-谷氨酸）赖氨酸二肽的非二硫共价键交联，鱼糜蛋白的聚集程度变大，从而使得凝胶网络结构增强，凝胶特性，乳化稳定性，持水性等增强，与前面的试验结果一致。

图3 鱼糜蛋白-脂质复合凝胶的SDS-PAGE 图谱Fig.3 SDS-PAGE pattern of surimi protein-lipids composite gels

图4 添加不同含量TGase 的鱼糜蛋白-脂质复合凝胶的扫描电镜图（上）和对应的阈值化图（下）Fig.4 Scanning electron microscopy images of surimi protein-lipids composite gels with different concentration of TGase （up）and corresponding binary images （down）

图5 添加不同含量TGase 的鱼糜蛋白-脂质复合凝胶的分形维数DfFig.5 Example of box count plots for the determination of Df from SEM binary images of surimi protein-lipids composite gels with different concentration of TGase

3 结论

本试验结果表明， 加入不同含量的TGase 后鱼糜蛋白-脂质复合凝胶的质构特性、 水分分布、分子间作用力、MHC 条带强度、 微观结构等发生了显著变化。 结果表明， 随着TGase 添加量的增加， 鱼糜凝胶蛋白的MHC 条带强度逐渐变浅，蛋白中形成的非二硫共价键（ε-（γ-谷氨酰基）赖氨酸共价键）逐渐增加， 蛋白网络结构变得更加致密；外在表现为鱼糜凝胶的硬度、乳化稳定性和持水性等增加，当TGase 添加量为0.4%时，鱼糜蛋白-脂质复合凝胶表现出较好凝胶特性，此后趋于稳定。