化痰消瘀方通过调节自噬对大鼠癌前病的改善作用

赵 艳 吴海涛

（胜利油田中心医院 药学部， 山东 东营257034）

胃癌（gastric cancer，GC） 是常见的恶性肿瘤，发病率在全球癌症发病位居第4 位，病死率第2 位［1］。流行病学统计显示，我国也是GC 高发国，大约每3 分钟就有一名中国人死于胃癌。GC 的发病机理尚不十分清楚，GC 的治疗仍是恶性肿瘤的难题［2］。GC 发病前为胃癌前病变（precancerous lesions of gastric cancer，PLGC），PLGC 是慢性胃病出现的肠上皮化生及异型增生，其发展为GC 的概率较高，若能及时阻止PLGC 演进至GC 的恶性过程，就有可能阻止GC 发生，但目前西医仍缺乏有效的治疗药物［3-4］。

中医学没有胃癌前病变的病名，根据临床表现可将其归为“痞满” “癥瘕” “胃脘痛” 等范畴。清代名医叶天士在《临证指南医案》 有云“胃痛久而屡发，必有凝痰聚瘀”。“痰浊”与“瘀血”是胃病共有的病理环节，“痰瘀”的形成贯穿于疾病整个过程，不止在GC 发生之后，而是在PLGC 时就已存在。临床与动物研究也已证实“痰浊” “瘀血” 与PLGC 的关系紧密［5］。化痰消瘀方是胜利油田中心医院根据多年的临床经验，在二陈汤的基础上化裁获得的经验方。多年临床研究也显示化痰消瘀方在治疗胃病变获得了较好的效果，但其机理尚不明确。研究显示自噬与许多疾病的发生密切相关，自噬是细胞程序性死亡方式，自噬与PLGC 及GC 演变过程密切相关，自噬在GC 发生中具有重大意义［6］。本课题拟考察化痰消瘀方对PLGC 大鼠疗效及对自噬相关基因的影响。

1 材料

1.1 动物 SPF 级雄性Wister 大鼠，体质量180～220 g，购自北京维通利华实验动物有限公司，生产许可证号SCXK（京） 2006-0009。所有大鼠适应性饲养7 d，期间自由饮食饮水。

1.2 药物与试剂化痰消瘀处方由陈皮、法半夏20 g，猪苓、莪术、紫丹参和薏苡仁各15 g组成，加入药材5 倍质量的纯净水，中火煎煮2 次，40 min／次，合并煎液，调整浓度3 g 生药／mL。药材陈皮、法半夏、猪苓、莪术、紫丹参和薏苡仁的产地分别为广东新会、四川成都、贵州贵阳、广西桂林、云南大理和湖北蕲春，药材均购于东营百草堂中药饮片有限公司，由胜利油田中心医院药学部的副主任药师张丽芝鉴定分别为芸香科植物橘的成熟果皮、天南星科植物半夏的块茎、非褶菌目多孔菌科树花属药用真菌、姜科植物莪术的干燥根茎、唇形科紫丹参的干燥根及根茎和禾本科植物薏苡的干燥成熟种仁。甲硝基亚硝基胍（美国Sigma 公司），临用前配制，用超纯水配制质量浓度为100 μg／mL 溶液，避光保存；胃复春片（杭州胡庆余堂药业有限公司，规格0.36 g／片，国药准字Z20040003）；DNA 提取试剂盒（美国Promega 公司，货号A1120）；免疫组织化学染色SP 试剂盒（北京中山生物技术公司，批号30577916）；LC3（货号ab48394）、Raptor（货号ab62557）、Beclin-1（货号ab202319） 一抗均购自英国Abcam 公司；辣根酶标记山羊抗兔二抗（上海博蕴科技有限公司，批号190801）；逆转录试剂盒（美国Thermo 公司，货号K1622）；BCA 蛋白定量试剂盒（中国碧云天生物技术研究所，批号20190306）；脱氧胆酸钠（批号201903）、乙 醇（批号201901） 为化学纯购自东营市华振化工有限公司，临用前配置，浓度分别为20 mmol／L 和40%。

1.3 仪器 GeneAmp 9600型PCR 反应扩增仪（美国ABI公司）；NAS-99型紫外分光光度计（美国ACTGene 公司）；Centrifuge5415D型离心机（德 国 Eppdendorf 公 司）；BC-subMIDI型电泳仪（北京六一仪器厂）；BX 50-3E01型显微镜（日本奥林巴斯公司）。

2 方法

2.1 PLGC 大鼠制备 取SPF 级雄性Wister 大鼠给予含有0.03%雷尼替丁的颗粒饲料；第2 周，每日饮用甲硝基亚硝基胍溶液（避光处理），同时进食2 d 和禁食1 d 的饥饱交替法。进食日上午8：00 至12：00 给予55℃15%氯化钠溶液（10 mL／kg） 灌胃，下午14：00 至17：00 给予脱氧胆酸钠溶液（10 mL／kg） 灌胃；禁食日下午14：00 至17：00 给予乙醇（10 mL／kg） 剂量灌胃。灌胃前后1 h 必须禁食禁水，用钳子钳住所有制备PLGC 大模型的大鼠尾部，每次30 min，1 次／7 d，使大鼠处于激怒的状态，造模持续6个月。

2.2 分组及给药 将大鼠随机分为对照组、模型组、化痰消瘀方低剂量组、化痰消瘀方高剂量组、阳性药胃复春组，每组15 只。对照组和模型组大鼠每日予生理盐水（10 mL／kg）灌胃，化痰消瘀方低、高剂量组分别灌胃给予5、10 g 生药／kg 化痰消瘀方，胃复春组给予0.5 g／kg 胃复春片，连续给药4个月。每日记录大鼠在治疗过程的生存状况和体质量

2.3 HE 染色观察胃窦部组织病理状态 给药结束后，大鼠禁食不禁水12 h，取胃组织，用生理盐水洗净，取胃窦部组织用10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE 染色，镜下观察病变。

2.4 免疫组化检测LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表达 取各组胃黏膜组织石蜡标本切片，脱蜡，水化，高压热修复抗原，3% H2O2氧化15 min，滴加LC3、Raptor、Beclin-1 一抗（1∶50），4℃过夜，滴加二抗，37℃孵育30 min，DAB 显色，苏木素复染，脱水透明，封片。PBS 替代一抗作为阴性对照，免疫组织化学染色阳性为棕褐色或黄色。按强度评分，无色0 分，浅黄色1 分，棕黄色2 分，棕褐色3 分；染色强度按阳性细胞百分比评分，阴性0 分，阳性细胞≤10% 1 分，11%～50% 2 分，51%～75% 3 分，≥75% 4 分。蛋白表达＝强度×阳性细胞百分比。

2.5 Western blot 检测胃黏膜组织LC3、Raptor、Beclin-1蛋白表达 取各组胃黏膜组织，加入400 μL RIPA 裂解组织，4℃离心取上清，BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，将蛋白定量为2.0 g／L，煮沸10 min，电泳，转至PVDF 膜，封闭2 h，漂洗，加入LC3（1∶100）、Raptor（1∶100）、Beclin-1（1∶100）、GAPDH（1∶5 000） 一抗，4℃孵育过夜，TBST 洗涤，二抗孵育1 h，TBST 洗涤，加ECL 工作液，显影，分析，获得待测蛋白的相对表达。

2.6 RT-PCR 检测胃黏膜组织LC3、Raptor、Beclin-1 mRNA表达 按TRIzol RNA 试剂盒说明提取胃组织总RNA，以紫外分光光度计进行定量，取1 μg 总RNA 逆转录成cDNA。cDNA 合成体系，焦磷酸二乙酯2 μL，反转录缓冲液5 μL，上游和下游引物各1.0 μL，加双蒸水补至25 μL，37℃反应50 min；将合成的cDNA 置于PCR 反应体系中扩增，反应体系为cDNA 1.0 μL，10×buffer 2.5 μL，Dntp 0.5 μL，Taq 酶1.0 μL，延伸体系2.0 μL，超纯水15 μL，上游和下游引物各0.5 μL，加双蒸水补至23 μL，反应条件96℃预变性1 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，40个循环，72℃延伸5 min，以β-actin为内参，计算待测基因的相对表达量。

表1 引物序列

2.7 统计学分析 采用SPSS 19.00 统计软件进行分析，计量资料以（） 表示，多组间比较采用方差分析；等级资料采用秩和检验，以P≤0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠一般生存状况及体质量改变 对照组大鼠色白有光泽，活动敏捷，食量正常，大便呈颗粒状，尾淡红色。模型组大鼠毛色黄而无光，活动迟钝，形体偏瘦，食量少，可见便溏，尾色淡白色。化痰消瘀方低、高剂量组及胃复春组大鼠的生存状况介于对照组与模型组之间。如表2 所示，治疗前，与对照组比较，其余组大鼠体质量均降低（P＜0.05）。治疗后，与对照组比较，模型组大鼠体质量降低（P＜0.05）；与模型组比较，化痰消瘀方组、胃复春组体质量增加（P＜0.05）。

表2 各组大鼠的体质量比较（g， x±s， n＝15）

3.2 大鼠胃组织病理改变 如图1 所示，对照组大鼠胃黏膜上皮完整，固有膜内的腺体紧密排列且整齐，细胞形态相同，淋巴细胞少量散在，无明显的炎症细胞浸润；模型组大鼠胃黏膜腺体萎缩或消失，腺体可见共壁，固有层内可见炎细胞浸润，浸润深至黏膜肌层，淋巴细胞聚集于黏膜，血管有增生，腺体紊乱，基底部腺体上皮增生；化痰消瘀方低、高剂量组胃体和胃窦部黏膜炎症较轻，可见充血、水肿及上皮细胞坏死脱落、淋巴细胞浸润，少量的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润；胃复春组胃黏膜上皮较完整，少量散在的淋巴细胞，炎性细胞浸润黏膜浅层，部分腺体出现萎缩。化痰消瘀方低、高剂量组和胃复春组的胃组织病理改变介于对照组与模型组之间，腺体排列较整齐，细胞形态大略相同，炎症细胞浸润、充血、水肿及上皮细胞坏死脱落减少。

图1 大鼠胃组织病理学观察（×200）

3.3 大鼠胃组织LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表达 如图2～3、表3 所示，胃组织LC3、Raptor、Beclin-1 均在细胞核或细胞浆中表达。与对照组比较，模型组大鼠胃组织LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表达增高（P＜0.05）；与模型组比较，化痰消瘀方高剂量组、胃复春组胃LC3、Raptor、Beclin-1蛋白表达降低（P＜0.05）；与化痰消瘀方低剂量组比，化痰消瘀方高剂量组胃LC3、Raptor 蛋白表达降低（P＜0.05）。

3.4 大鼠胃组织LC3、Raptor、Beclin-1 mRNA 表达 如表4、图4 所示，与对照组比较，模型组大鼠胃LC3、Raptor、Beclin-1 mRNA 表达增高（P＜0.05）；与模型组比，化痰消瘀方组和胃复春组胃LC3、Raptor、Beclin-1 mRNA 表达降低（P＜0.05）。

4 讨论

化痰消瘀方由陈皮、法半夏、猪苓、莪术、紫丹参和薏苡仁6 味中药组成，方中陈皮味苦、辛，性温，归肺、脾二经，可理气降逆、燥湿化痰、健脾行气；法半夏味辛，性温，可化痰降逆、调脾胃升降之气机，与陈皮联用可增强理气化湿和胃的功效；猪苓利水渗湿；莪术活血行气、破血消癥；紫丹参活血化瘀、通经止痛、瘀滞消除；薏苡仁味甘、淡，性凉，归脾胃肺经，健脾利湿，诸药共奏健脾理气及化痰消瘀之功［7-13］。多年的临床研究显示，化痰消瘀方具有保护胃黏膜、改善胃黏膜血液循环、增强黏膜上皮细胞的再生及修复功能，可逆转慢性萎缩性胃炎，改善肠上皮化生或异型增生。本研究显示，给予PLGC 大鼠化痰消瘀方连续4个月，PLGC 大鼠的生存状态明显改善，胃组织炎症、水肿、上皮细胞坏死脱落和淋巴细胞浸润等病变均明显改善，进一步证实了化痰消瘀方对胃病变具有明确的治疗效果。

图2 免疫组化检测各组大鼠胃组织LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表达（×200）

图3 Western blot 检测各组大鼠胃组织LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表达

表3 各组大鼠胃组织LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表达比较（， n＝15）

表3 各组大鼠胃组织LC3、Raptor、Beclin-1 蛋白表达比较（， n＝15）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与化痰消瘀方低剂量组比较，△P＜0.05。

表4 各组大鼠胃LC3、 Raptor、 Beclin-1 mRNA 表达比较（， n＝15）

表4 各组大鼠胃LC3、 Raptor、 Beclin-1 mRNA 表达比较（， n＝15）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与化痰消瘀方低剂量组比较，△P＜0.05。

图4 RT-PCR 检测各组大鼠胃LC3、Raptor、 Beclin-1 mRNA 表达

细胞自噬作为依赖溶酶体的降解途径，肿瘤细胞的自噬对于肿瘤细胞的生长具有至关重要的作用，肿瘤细胞因为生长快速而导致肿瘤细胞处于相对缺氧状态，肿瘤细胞可通过自噬提供营养及能量，促进肿瘤的持续生长。LC3是细胞自噬发生的敏感标志物，LC3 表达可用于评估自噬的活性程度，研究［14-15］报道与非癌或癌旁组织比，胃癌组织中LC3 表达异常升高。PI3K／AKT／mTOR 信号通路对自噬发挥重要调控作用，Raptor 是该通道的核心分子，参与调控蛋白质合成、代谢、血管生成和自噬等过程，Raptor表达可反映mTOR 的生物学活性。研究表明，Raptor 在早期胃癌组织表达不仅高于正常胃黏膜也高于慢性萎缩性胃炎胃组织，Raptor 在胃癌的表达越高，患者的预后越差，在胃上皮内瘤变阶段，Raptor 被激活，细胞开始处于活跃增殖状态。Beclin-1 在人类癌症发病机制中起关键作用，胃癌组织Beclin-1 的高表达提示肿瘤细胞处于活跃生长期［16-18］。本课题结果显示，与对照组比较，PLGC 模型组大鼠胃组织的LC3、Raptor 和Beclin-1 蛋白及mRNA 表达明显增高。既往的病理研究认为，当胃部发生炎性反应时，胃黏膜的腺体呈现萎缩与减少，萎缩的细胞内自噬泡、微囊泡和残留小体显著增加，再加上固有腺黏液颗粒扩张，自噬泡容易被机械挤压到胞膜下直至与细胞膜融合，因此细胞膜的LC3、Raptor 和Beclin-1 表达增高，一定程度反映了胃病变的程度［19］。给予化痰消瘀方后，PLGC 大鼠胃组织的LC3、Raptor 和Beclin-1 蛋白及mRNA 均明显降低，提示化痰消瘀方有助于抑制PLGC 的自噬。相关的文献报道，化痰消瘀方中的组成或成分对LC3、Raptor 和Beclin-1 相关的自噬具有一定的抑制作用，如黄小波等［20］分离培养HUVEC细胞，考察陈皮-半夏对Beclin-1 和LC-3 等自噬通路的调节作用，结果显示陈皮-半夏可能通过抑制HUVEC 细胞中Beclin-1 和LC-3 的表达，而发挥提高内皮细胞存活率，治疗动脉粥样硬化的作用。唐丹丽等［21-22］研究显示，与空白对照组比较，含有半夏的栝蒌薤白半夏汤组可降低心肌细胞的Beclin-1 和LC-3 表达，从而抑制自噬而起到心肌保护作用。白晔等［23］体外研究显示，采用石油醚提取含有半夏和茯苓的化痰消食方可通过下调LC3 表达而拮抗内皮细胞的自噬性死亡。

综上所述，PLGC 存在明显的细胞自噬，化痰消瘀方可用于治疗PLGC，其可能机理在于降低胃LC3、Raptor 和Beclin-1 自噬相关蛋白及mRNA 表达。