石韦化学成分及其生物活性

何 康 范琳琳 伍天苔 申琳燕 王 绘 张 平 邹 娟

（贵州中医药大学， 贵州 贵阳550025）

水龙骨科石韦属植物全世界约有100 多种，中国现知有37 种［1］。该属植物贵州分布约有13种［2］，其中石韦Pyrrosia lingua（Thunb.） Farwell为《中国药典》 收载品种，在贵州少数民族地区，用于治疗蛇毒咬伤等，也是贵州资源最丰富的种之一。目前，以石韦为主要原料的各种石韦复方制剂在临床上广泛应用，市场上常见的“复方石韦片”“结石通片” “石韦胶囊” 等中成药的疗效得到了广泛认可［3］。最早为日本学者于1963 年从石韦中分离得到三萜类化学成分里白烯［4］，我国学者是从1984 年开始对该属植物进行化学成分研究［5］。现有文献报道表明该属植物中的化学成分主要有三萜、黄酮、口山酮类等［6］。

为寻找贵州产石韦中的药效物质，本研究对黔产石韦的化学成分和生物活性进行研究。从该植物中分离得到7个化合物，其中化合物3～6 为首次从该植物中分离得到。由于何帕烷型三萜主要来源于微生物中，植物源何帕烷型三萜化合物相对较少，对其活性研究也较少［7］。因此，本实验对其中3个何帕烷型三萜类化合物进行抗肿瘤、抗细菌、抗真菌活性筛选。结果显示，化合物2～3 对Hela 细胞有弱抑制作用，化合物1～2 对MCF-7 细胞有弱抑制作用，化合物3 对HepG 2 细胞有弱抑制作用，被测试化合物均不显示抗菌活性。

1 材料

1.1 药材 实验药材于2015 年9 月采自贵州遵义，原植物经贵阳中医学院赵俊华教授鉴定为水龙骨科石韦属石韦Pyrrosia lingua（Thunb.） Farwell，植物标本存放于贵州中医药大学苗医药重点实验室，标本号为20150905101。

1.2 细胞、菌株及试剂供试肿瘤细胞株（A549、BEL-7402、HepG 2、Hela、MCF-7）、细菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌） 和真菌（黑根霉、黑曲霉、白色假丝酵母菌） 均由贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室提供和保存。RPMI 1640 培养液、胎牛血清（FBS，美国Hyclone 公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT，美国Genview 公司）；二甲基亚砜（DMSO，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。蛋白胨、酵母提取物（美国Oxoid 公司）；牛肉膏和琼脂（美国Sigma 公司）。Sephadex LH-20（美国通用电气医疗集团）；GF254制备薄层板及200～300目柱色谱用硅胶（青岛海洋化工有限公司）；所用试剂均为分析纯。

1.3 仪器 酶标仪（美国Biotek 公司）；二氧化碳培养箱（美国Thermo Scientific 公司）；立式压力蒸气灭菌器（上海申安医疗器械厂）；Allega X-15R台式离心机（美国贝克曼库尔特公司）；Bruker Q-TOF 质谱仪（德国布鲁克公司）；Varian Inova-400 MHz 核磁共振仪（美国瓦里安公司）；Buchi R215 实验室规模旋转蒸发仪（瑞士步琪实验室仪器公司）；FZ102 微型植物粉碎机（上海书培实验设备有限公司）；Metter-Toledo 电子天秤（瑞士Metter-Toledo 公司）。

2 提取与分离

自然干燥的石韦全草25.1 kg，粉碎成粗粉（60～80目），用85% 乙醇回流提取3 次（每次1 h），过滤提取液，减压回收乙 醇后得浸膏2.8 kg。浸膏用蒸馏水溶解后经D101 大孔树脂柱，分别用水、50%乙醇、90%乙醇梯度洗脱，得到石韦50%、90%乙醇部分分别为251、132 g。90%乙醇部分先进行硅胶柱层析，二氯甲烷-乙酸乙酯（100∶1～8∶2） 梯度洗脱，得到2个组分Fr.A1和Fr.A2。Fr.A1组分中析出结晶部分经石油醚-乙酸乙酯（100∶1～8∶2） 梯度洗脱，重结晶后用Sephadex LH-20 进行纯化，得到化合物 2（215 mg）、3（240 mg）。Fr.A1组分母液部分进行硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯（100∶1～8∶2）梯度洗脱，得到4个组分Fr.A1-1～Fr.A1-4。Fr.A1-2 部分重结晶后用Sephadex LH-20 纯化，得到化合物1（1.172 g）。Fr.A1-3 部分经石油醚-乙酸乙酯（100∶1～8∶2） 梯度洗脱，用Sephadex LH-20 进行纯化，得到化合物4（18 mg）、7（14 mg）。50%乙醇部分经二氯甲烷-甲醇（95∶5～8∶ 2）梯度洗脱，得到2个部分Fr.B1 和Fr.B2。Fr.B1 经二氯甲烷-乙酸乙酯（100∶5） 洗脱得到化合物5（13 mg）、6（116 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末，10%硫酸-乙醇溶液加热显紫红色。ESI-MSm／z：427［M ＋H］＋，分子式C30H50O。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：3.97（1H，d，J＝11.3 Hz，H-28），3.14（1H，d，J＝11.3 Hz，H-28），1.29（3H，s，H-29），1.11（3H，s，H-30），0.97（6H，s，H-26，27），0.84（3H，s，H-23），0.81（3H，s，H-25），0.79（3H，s，H-24）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：15.8（C-1），16.3（C-2），16.4（C-3），18.7（C-4），18.8（C-5），18.7（C-6），33.6（C-7），42.1（C-8），50.7（C-9），37.6（C-10），21.2（C-11），23.7（C-12），47.9（C-13），42.0（C-14），32.8（C-15），23.5（C-16），49.7（C-17），43.1（C-18），36.0（C-19），26.5（C-20），47.8（C-21），74.8（C-22），33.5（C-23），21.7（C-24），16.1（C-25），16.7（C-26），17.2（C-27），65.6（C-28），26.1（C-29），30.2（C-30）。以上数据与文献［8］基本一致，故鉴定为22，28-epoxyhopane。

化合物2：白色粉末，10%硫酸-乙醇溶液加热显紫红色。ESI-MSm／z：427［M-H］-，分 子式C30H52O。1H-NMR（400 MHz，C5D5N）δ：5.00（2H，s，H-29），4.13（1H，d，J＝10.2 Hz，H-28），3.94（1H，d，J＝10.2 Hz，H-28），1.80（3H，s，H-30），1.27（3H，s，H-27），1.04（3H，s，H-26），0.89（3H，s，H-23），0.84（3H，s，H-25），0.83（3H，s，H-24）；13C-NMR（100 MHz，C5D5N）δ：40.7（C-1），19.2（C-2），42.8（C-3），33.0（C-4），56.5（C-5），19.3（C-6），34.0（C-7），42.8（C-8），51.2（C-9），37.8（C-10），22.1（C-11），26.8（C-12），51.2（C-13），42.5（C-14），34.4（C-15），22.1（C-16），55.0（C-17），50.3（C-18），36.6（C-19），28.2（C-20），46.7（C-21），149.5（C-22），33.8（C-23），22.1（C-24），16.3（C-25），17.8（C-26），17.4（C-27），60.9（C-28），110.3（C-29），25.8（C-30）。以上数据与文献［8］基本一致，故鉴定为hop-22（29） -en-28-ol。

化合物3：白色粉末，10%硫酸-乙醇溶液加热显紫红色。ESI-MSm／z：441［M ＋H］＋，分子式C30H48O2。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：1.45（3H，s，H-30），1.29（3H，s，H-29），0.98（3H，s，H-27），0.96（3H，s，H-26），0.84（3H，s，H-23），0.83（3H，s，H-25），0.78（3H，s，H-24）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：40.4（C-1），18.8（C-2），42.2（C-3），33.4（C-4），56.3（C-5），18.8（C-6），33.9（C-7），42.8（C-8），50.4（C-9），37.6（C-10），21.7（C-11），24.9（C-12），45.8（C-13），41.7（C-14），32.7（C-15），25.2（C-16），49.8（C-17），50.8（C-18），35.5（C-19），25.6（C-20），50.6（C-21），82.2（C-22），33.5（C-23），21.8（C-24），16.0（C-25），16.4（C-26），16.4（C-27），176.5（C-28），29.4（C-29），30.0（C-30）。以上数据与文献［9］基本一致，故鉴定为hopan-28，22-olide。

化合物4：白色粉末，10%硫酸-乙醇溶液加热显紫红色。ESI-MSm／z：439［M ＋H］＋，分子式C31H50O。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：4.66（2H，m，H-26），1.64（3H，s，H-27），1.10（3H，s，H-29），1.04（3H，s，H-28），1.03（3H，d，J＝7.2 Hz，H-31），0.91（3H，s，H-18），0.89（3H，s，H-30），0.87（3H，d，J＝6.6 Hz，H-21），0.78（1H，d，J＝4.2 Hz，H-19a），0.57（1H，d，J＝4.2 Hz，H-19b）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：33.4（C-1），37.5（C-2），216.7（C-3），50.3（C-4），48.4（C-5），21.5（C-6），28.1（C-7），47.9（C-8），21.1（C-9），26.0（C-10），26.8（C-11），32.8（C-12），48.7（C-13），45.4（C-14），35.9（C-15），25.9（C-16），52.3（C-17），18.1（C-18），29.6（C-19），36.0（C-20），18.3（C-21），33.9（C-22），31.5（C-23），41.6（C-24），150.2（C-25），109.4（C-26），18.6（C-27），22.2（C-28），20.8（C-29），19.3（C-30），20.2（C-31）。以上数据与文献［10］基本一致，故鉴定为cyclolaudenone。

化合物5：无色油状，10%硫酸-乙醇溶液加热显黑色。ESI-MSm／z：341［M-H］-，分子式C16H22O8。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.07（1H，d，J＝10.2 Hz，H-5′），6.68（1H，d，J＝2.1 Hz，H-2′），6.60（1H，dd，J＝10.2，2.1 Hz，H-6′），2.73（4H，brs，H-3，H-4），2.10（3H，s，H-1）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：30.0（C-1），211.1（C-2），45.9（C-3），30.2（C-4），138.2（C-1′），117.0（C-2′），145.1（C-3′），148.3（C-4′），119.0（C-5′），120.7（C-6′），104.6（C-1″），74.8（C-2″），77.5（C-3″），71.2（C-4″），78.2（C-5″），62.4（C-6″）。以上数据与文献［11］基本一致，故鉴定为4-（3′，4′-dihydroxyphenyl） -butan-2-one-4′-O-β-D-glucoside。

化合物6：无色油状，10%硫酸-乙醇溶液加热显黑 色。ESI-MSm／z：343［M-H］-，分子式C16H24O8。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.07（1H，d，J＝8.2 Hz，H-9），6.70（1H，s，H-6），6.61（1H，dd，J＝8.3，2.0 Hz，H-10），4.67（1H，d，J＝7.5 Hz，H-1′），3.87（1H，d，J＝10.5 Hz，H-6b′），3.70（1H，m，H-2），3.67（1H，dd，J＝11.5，4.9 Hz，H-6a′），3.28～3.50（4H，m，H-2′，3′，4′，5′），2.56（2H，m，H-4），1.66（2H，m，H-3），1.16（3H，d，J＝6.2 Hz，H-1）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：23.5（C-1），67.8（C-2），32.5（C-3），42.0（C-4），139.5（C-5），119.0（C-6），144.8（C-7），148.1（C-8），117.1（C-9），120.8（C-10），104.6（C-1′），74.8（C-2′），78.1（C-3′），71.2（C-4′），77.5（C-5′），62.3（C-6′）。以上数据与文献［12］基本一致，故鉴定为2-hydroxy-4-［（3S） -3-hydroxybutyl］phenyl-β-D-glucopyranoside。

化合物7：白色针晶体（乙酸乙酯），10% 硫酸-乙醇溶液加热显紫红色。通过与β-sitosterol 对照品的TLC 对照，用多种溶剂系统展开后其Rf 值及显色行为均相同［13］，故鉴定为β-sitosterol。

4 生物活性筛选

4.1 抗肿瘤采用 MTT 法，选用A549、BEL-7402、HepG 2、Hela、MCF-7 5 种细胞株，对分离得到的3个何帕烷型三萜进行体外活性测试。用RPMI 1640 完全培养液（含有10%胎牛血清），于37℃、5% CO2的培养箱内培养，取对数生长期细胞进行实验。取对数期细胞，离心，用10%胎牛血清的新鲜培养基重悬，按每孔8 000个细胞接种于96 孔板中，按浓度梯度为20、10、5、2.5、1.25 μmol／L 加入待测品，以DMSO 溶剂为对照组，阿霉素为阳性对照，放入培养箱中培养72 h，每个浓度设置4个复孔。用显微镜采集图片，离心，去除细胞培养液，加入10 μL MTT 的新鲜培养液，继续培养4 h，离心去除上清液，每孔加入160 μL DMSO，室温震荡15 min，在490 nm 光激发下用酶标仪测吸光度值（OD）。每次筛选平行3 次，重复2 次，实验结果以（） 表示。抑制率＝［（OD对照组-OD样品组） ／OD对照组］×100%。

实验结果显示，化合物1～2 对MCF-7 细胞有弱抑制作用，化合物2～3 对Hela 细胞有弱抑制作用，化合物3 对HepG 2 细胞有弱抑制作用，见表1。

表1 抗肿瘤实验抑制率（）Tab.1 Inhibition rate in antitumor tests（）

表1 抗肿瘤实验抑制率（）Tab.1 Inhibition rate in antitumor tests（）

4.2 抗菌 采用琼脂平板打孔法，选择大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，以及黑根霉、黑曲霉和白色念珠菌，以庆大霉素和制霉菌素作为阳性对照，设阳性对照药质量浓度为0.1 mg／mL，样品质量浓度为10 mg／mL，每孔加入40 μL，每个药物重复2 次，结果取平均值。将标准菌接种于培养基中，置37℃恒温培养箱中培养16～18 h。制备营养琼脂平板，用移液器吸取0.1 mL 菌液加入平皿中，然后用涂布器将菌液均匀涂布在营养琼脂平板上；再用打孔器在营养琼脂平板上等距离打6个孔，打孔直径为6.18 mm；将供试药液加于孔中，在37℃恒温箱中培养24 h，观察是否有抑菌圈，测量抑菌圈直径。结果显示，化合物1～3 均未产生抑菌圈，无抑菌活性。

5 结论

本研究从黔产石韦中分离得到7个化合物，其中化合物3～6 为首次从该植物中分离得到，对分离得到的3个何帕烷型三萜类化合物进行5 种肿瘤细胞株、3 种细菌和3 种真菌的抑制活性测试。结果显示何帕烷型三萜化合物具有微弱的抗肿瘤活性，但无抗菌活性。以期为石韦的合理用药和开发利用提供科学依据。