牛IGF2基因多态性与大别山牛生长性状的相关性分析

赵拴平， 徐 磊， 金 海， 李 默， 贾玉堂

(安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，畜禽产品安全工程安徽省重点实验室，合肥 230031)

我国是世界肉牛养殖大国和消费大国，依据地理分布，我国黄牛分为中原黄牛、北方黄牛和南方黄牛三大类[1]。大别山牛是中原黄牛的典型代表，主要分布于安徽省的太湖、岳西、桐城、潜山、金寨、宿松等县和湖北省大别山西部的湖北、河南部分地市。大别山牛长期以来作为农业生产的主要动力，形成了耐粗饲、抗病力强、肉质细腻、善爬坡的优良特点，但也同时具有个体小、生长慢等不足。因此，利用分子标记辅助选择技术开展大别山牛体尺性状的选育具有重要意义。

胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)基因是最早发现的内源性印迹基因，能够促进有丝分裂、诱导细胞分化、调节胚胎的生长发育以及参与肿瘤细胞增殖过程等[2-3]。近年来研究发现，IGF2基因在动物的生长发育中发挥重要作用。Thomsen等研究发现IGF2基因座位于猪2号染色体短臂末端，是影响肌肉生长和脂肪沉积的关键QTL[4]，韩瑞华等研究发现IGF2基因SNPs位点g.120C>T和g.279A>G与秦川牛胴体性状(宰前活重、胴体重、胴体长、胴体胸深、眼肌面积)显著相关(P<0.05)，与肉质性状(大理石花纹、嫩度、pH24)显著相关(P<0.05)，与背部皮下脂肪厚极显著相关(P<0.01)[5]；黄永震等研究发现IGF2基因4个SNPs位点及其单倍型与秦川牛体高、体长、胸宽、胸深和体重显著相关(P<0.05)[6]，与郏县红牛18～24月龄体重显著相关(P<0.05)[7]，说明IGF2基因对牛生长性状具有重要影响，为此，本研究采用PCR和测序技术探究IGF2基因SNPs位点与大别山牛群体体尺性状的相关性，以期为我国大别山牛生长性状的遗传改良提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

从国家肉牛牦牛产业技术体系合肥综合试验站试验基地安徽省阜阳市颍上县牛哥牧业科技有限公司和国家肉牛核心育种场安庆市太湖县久鸿农业综合开发有限责任公司随机选取238头健康、无亲缘关系的大别山母牛(24～48月龄)，试验牛生长环境和饲喂日粮无显著差异。

1.2 样品采集及体尺指标测定

采集试验牛黄豆大小的耳组织，放入加有75%乙醇的离心管中，冷藏于冰盒中带回实验室备用。采样同时测量试验牛的体斜长、体高、十字部高、胸围、腹围、管围、腰角宽、坐骨端宽等体尺数据。

1.3 引物设计与合成

以NCBI数据库中牛IGF2基因(NC_037356.1)为模板，利用Primer 5.0软件设计引物，上游引物为5′-TCTCTCTCCCGCAGACATCA-3′，下游引物为5′-CACACCCCCAGTGACTTTTA-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 IGF2基因多态性检测

利用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP304)进行牛组织样基因组提取，将提取好的DNA统一稀释到100 ng/μL冷藏备用。

利用设计的引物进行PCR扩增，扩增体系为：2*Taq Mix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA 模板1 μL，用ddH2O补充至25.0 μL。PCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min，32个循环(95 ℃变性30 s，56 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s)，72 ℃总延伸5 min，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性样品送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.5 数据统计与分析

根据基因型分析结果，计算基因型频率、等位基因频率、多态信息含量(PIC)、遗传杂合度(He)和有效等位基因数(Ne)，并进行Hardy-Weinberg平衡检验，利用SPSS 23.0软件分析SNPs位点的基因型与大别山牛生长性状的相关性，结果用“平均数±标准误”表示。

GLM模型：Yijk=μ+Ai+Gj+Eijk

式中：Yijk指第ijk个个体的性状；μ指群体总体平均值；Ai指年龄效应；Gj指遗传效应；Eijk指随机误差。

2 结果与分析

2.1 IGF2基因PCR产物检测

NCBI数据库显示牛IGF2基因(NC_037356.1)定位于29号染色体，包含10个外显子和9个内含子，其cDNA序列包含540 bp开放阅读框，编码179个氨基酸。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示，扩增产物电泳条带清晰，特异性较好，片段大小与预期一致。

注：M为DNA Marker；1～8为PCR产物。

图1 大别山牛IGF2基因第一内含子的PCR扩增结果

2.2 IGF2基因SNPs位点分析

通过PCR结合测序技术发现，IGF2基因第一内含子区存在3个SNPs位点，分别为g.22218G>A、g.22421C>T和g.22448G>T，g.22218G>A位点有GG、GA和AA 3种基因型，g.22421C>T位点有CC、CT和TT 3种基因型，g.22448G>T位点有GG、GT和TT 3种基因型(图2)。

图2 大别山牛IGF2基因SNPs位点测序结果

2.3 IGF2基因SNPs位点遗传参数分析

大别山牛IGF2基因SNPs位点的基因频率和基因型频率见表1。在g.22218G>A位点，等位基因G属于优势等位基因，基因型GG为优势基因型；在g.22421C>T位点，等位基因T为优势等位基因，基因型CT为优势基因型；在g.22448G>T位点，等位基因T为优势等位基因，基因型GT为优势基因型。卡方检验结果显示，3个SNPs位点均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，遗传指数(基因纯合度(Ho)、基因杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)如表1中所示，3个位点均属于中度多态(0.25

表1 大别山牛IGF2基因SNPs位点遗传参数分析

2.4 IGF2基因SNPs位点基因型对大别山牛生长性状的影响

利用SPSS 23.0软件分析IGF2基因第一内含子SNPs位点与大别山牛群体生长性状相关性结果如表2所示：g.22218G>A位点GG基因型和GA基因型个体的体斜长和胸围显著优于AA基因型个体(P<0.05)，GG基因型和GA基因型个体的腹围极显著优于AA基因型个体(P<0.01)；g.22421C>T位点CT基因型个体的体高和腰角宽显著优于CC基因型个体(P<0.05)，腹围极显著优于CC基因型个体(P<0.01)； g.22448G>T位点GT基因型个体的胸围显著优于GG和TT基因型个体(P<0.05)，GT基因型个体的腹围和腰角宽极显著优于GG和TT基因型个体(P<0.01)。

表2 牛IGF2基因第一内含子SNPs位点与大别山牛体尺性状的相关性分析

注：同一SNPs位点同列数据后标小写字母a，b表示差异显著(P<0.05)，标大写字母A、B表示差异极显著(P<0.01)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。

3 讨 论

研究利用PCR和测序技术寻找IGF2基因第一内含子的多态位点, 分析了3个SNPs位点不同基因型在大别山牛群体间的分布规律，为以后分子遗传标记的进一步确定进而实现标记辅助选择提供基础。研究发现IGF2基因第一内含子区存在3个SNPs位点(g.22218G>A、g.22421C>T和g.22448G>T)，且每个SNPs位点均有3种基因型，基因内含子区的SNPs位点虽然不参与转录过程，但大量研究发现基因内含子可以作为转录调控的增强子或抑制子进而影响转录效率，通过调节核小体位置控制DNA结合而调节转录过程[8-9]，因此，本研究发现的SNPs位点可以通过作为转录调控因子间接参与转录过程而发挥其生物学作用。

多态信息含量(PIC)和杂合度(He)是度量群体内遗传变异的标记，数值越高，说明遗传变异越大，选择潜力越大。大别山牛群体IGF2基因第一内含子区的3个SNPs位点均属于中度多态(0.25

4 结 论

IGF2基因第一内含子区3个SNPs位点均与大别山牛部分体尺性状具有显著或极显著相关性，提示其可作为大别山牛分子标记辅助选择的有效DNA分子标记。