基于特异性对硫磷单克隆抗体的间接竞争酶联免疫吸附分析方法建立

吕丽兰 张娅 邹承武 甘志勇 吴静娜 李乾坤 吕玉莲 易国强 温绍聪 何丽珊

摘要：【目的】制备特异性识别对硫磷（PA）的单克隆抗体，建立其间接竞争酶联免疫吸附分析方法（ic-ELISA），为实现对硫磷的农残快检提供技术支持。【方法】以化合物4-（二乙氧基硫代磷酸酯基）苯甲酸为半抗原，分别与牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶联制备人工抗原，免疫7周龄Balb/c雌性小鼠，取抗血清效价最高、特异性最优小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，采用间接酶联免疫方法（i-ELISA）及ic-ELISA分别评价融合细胞株的阳性和特异性，通过有限稀释法筛选稳定分泌对硫磷抗体的单克隆细胞株。再通过棋盘格试验筛选出抗原抗体最佳工作浓度组合建立对硫磷ic-ELISA标准曲线，并基于对硫磷单克隆抗体与各结构类似物的交叉反应率，评估ic-ELISA的特异性。采购西红柿样品进行對硫磷的添加回收试验，运用气相色谱法（GC）验证ic-ELISA的准确性。【结果】成功合成对硫磷人工抗原PA-BSA和PA-OVA，经5次免疫后融合小鼠的血清效价为8×103;通过有限稀释法筛选获得灵敏度高、特异性最强的对硫磷单克隆细胞株4F11A10。以2 μg/mL包被抗原PA-OVA、0.25 μg/mL细胞株4F11A10分泌抗体为最佳抗原抗体工作浓度组合，建立对硫磷ic-ELISA及其标准曲线，其半抑制浓度（IC50）为50 ng/mL，检测范围（IC20～IC80）为2.34～300 ng/mL;所建立的对硫磷ic-ELISA与5种有机磷农药（丙溴磷、杀扑磷、倍硫磷、水胺硫磷和甲拌磷）均无交叉反应。对比ic-ELISA和GC测定西红柿样品中对硫磷的添加回收试验结果，发现ic-ELISA的添加回收率为84.86%～100.27%，GC的添加回收率为97.60%～106.40%，两种方法的检测结果一致性较好。【结论】建立的ic-ELISA可用于快速检测蔬菜、水果等农产品中的对硫磷残留。

关键词： 对硫磷;间接竞争酶联免疫吸附分析方法（ic-ELISA）;单克隆抗体;气相色谱法（GC）

中图分类号： S482.3                              文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）05-1193-08

Abstract：【Objective】To develop of monoclonal antibody against parathion（PA） and establish its indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay（ic-ELISA） to provide technical support for the rapid detection of parathion residue. 【Method】4-（diethoxyphosphorothioyloxy） benzoic acid was used as hapten to prepare artificial antigen by coupling with bovine serum albumin（BSA） and ovalbumin（OVA）. The spleen cells of the immunized 7-week-old Balb/c female mice whose antiserum titer was the highest and specificity was the optimal were fused with SP2/0 myeloma cells. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay（i-ELISA） and ic-ELISA were used to evaluate the positivity and specificity of the fusion cell lines， respectively. The monoclonal cell lines secreting parathion antibody stably were screened by limited dilution method. The standard curve of ic-ELISA for parathion was established based on the best working concentration combination of antigen and antibody selected by checkerboard test. And the specificity of the established ic-ELISA for parathion was evaluated based on cross-reactivity rates between parathion monoclonal antibody and each analogue. The ic-ELISA was used to test the recovery of parathion in tomato samples， and its accuracy was verified with gas chromatography（GC）. 【Result】Parathion artificial antigen PA-BSA and PA-OVA were successfully synthesized. After five times of immunization， the serum titer of the fusion mice was 8×103. The cell line 4F11A10 with the highest sensitivity and specificity of parathion was selected by limited dilution method. The ic-ELISA for parathion and its standard curve were established by using 2 μg/mL coated antigen PA-OVA and 0.25 μg/mL antibody secreted from cell line 4F11A10 as the best working concentration combination of antigen and antibody. The 50% inhibiting concentration（IC50） of this method was 50 ng/mL， and the detection range（IC20-IC80） was 2.34-300 ng/mL. There was no cross reactivity between ic-ELISA for parathion and five organophosphorus pesticides（profenofos， methidathion， fenthion， isocarbophos， phorate）. The results of parathion recovery tests in tomato samples determined by ic-ELISA and GC were compared. The recoveries of ic-ELISA and GC were 84.86%-100.27% and 97.60%-106.40%， respectively. The results of the two methods were consistent. 【Conclusion】The established ic-ELISA method can be used for the rapid detection of parathion residues in vegetables， fruits， and other agricultural products.

Key words： parathion; indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay（ic-ELISA）; monoclonal antibody; gas chromatography（GC）

Foundation item： Guangxi Key Research and Development Project（Guike AB17292070）; Guangxi Natural Science Foundation（2017GXNSFBA198241）;Guangxi Innovation Driven Development Project（Guike AA17204043）;Basic Scien-tific Research Project of Guangxi Subtropical Crops Research Institute（Guireyan 201702）

0 引言

【研究意义】对硫磷（Parathion，PA）是一种有机磷类杀虫剂，其作用机制是通过抑制乙酰胆碱脂酶活性，干扰昆虫神经冲动传导进而达到杀虫目的。该农药能通过多种途径暴露进入人体，中毒重症者昏迷苏醒后，有时会产生兴奋、语无伦次、幻觉等精神症状（Butler-Dawson et al.，2016;Soares et al.，2019）。我国于2002年已禁止使用对硫磷，但在水体、土壤、空气及蔬菜中仍可检测到该农药的残留。因此，为保证人体健康和饮用水源及蔬菜产品的安全，建立一种特异性针对对硫磷农药残留的快速检测方法显得尤为重要。【前人研究进展】近年来，主要使用色谱法检测农产品中的对硫磷残留情况（林塬等，2018;戚文华等，2019）。这些实验室大型仪器检测方法准确、灵敏，但存在费时、价格昂贵、操作繁琐等问题而难以实现现场快速检测。酶联免疫分析（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种基于抗原抗体的特异性结合反应分析方法，具有快速、灵敏、价廉、省时、能实现现场快速筛选及检测等优点（王华等，2007）。Wettach等（2002）利用兔抗血清建立了对硫磷间接竞争酶联免疫吸附检测方法（Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，ic-ELISA），其中对硫磷的半抑制浓度（IC50）为5.5 μg/L，但该方法与对氧磷、甲基对硫磷、O，O，O-三乙基硫代磷酸酯等多个对硫磷结构类似物均存在交叉反应。我国也有一些学者针对对硫磷的免疫检测方法进行探究。邓浩等（2013）利用免疫新西兰大白兔所获抗血清建立了对硫磷间接竞争化学发光酶联免疫吸附分析方法，該方法的检测线性范围为0.24～15.83 μg/L，IC50为1.14 μg/L，检出限为0.09 μg/L;李晓丽等（2017）建立的对硫磷ic-ELISA检测线性范围为0.012～24.14 μg/mL，IC50为0.542 μg/mL，检出限为0.00343 μg/mL。此外，有研究人员利用有机磷农药广谱特异性单克隆抗体检测对硫磷。李盼等（2017）建立的ic-ELISA能同时检测14种有机磷农药，但检测对硫磷的IC50较高;邹茹冰等（2017）通过运用宽谱特异性单克隆抗体建立了同时检测3种有机磷类农药（对硫磷、甲基对硫磷和杀螟硫磷）的化学发光酶联免疫分析法。【本研究切入点】现有的对硫磷免疫检测方法大多存在与多种有机磷农药交叉反应的现象，参照我国现行GB 2763—2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》蔬菜样品中对硫磷农药最大残留限量的要求，本研究拟在单克隆细胞株筛选阶段，提前采用ic-ELISA检测细胞株分泌抗体与部分对硫磷结构类似物的交叉反应情况，以保证所筛得抗体的特异性，并以此建立高灵敏度、高特异性的对硫磷ic-ELISA。【拟解决的关键问题】筛选针对对硫磷的高特异性单克隆抗体，建立高灵敏度、高特异性的对硫磷ic-ELISA，为实现现场快速、专一筛选对硫磷农药残留产品提供更简便、经济的检测手段，也为后期流动层析免疫分析方法的开发提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

7周龄的Balb/c雌性小鼠购自广州动物实验中心;小鼠骨髓瘤细胞SP2/0由中国农业大学提供;试验所用蔬菜购自广西南宁市本地市场。6种有机磷类化合物标准物质[对硫磷（99.0%）、丙溴磷（99.0%）、杀扑磷（99.0%）、倍硫磷（99.0%）、水胺硫磷（99.0%）和甲拌磷（99.0%）]购自农业农村部环境保护科研监测所;弗氏佐剂、基础培养液（DMEM）、HAT粉样和胎牛血清购自美国Sigma公司;辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

主要仪器设备：UV-2600紫外可见分光光度计[岛津企业管理（中国）有限公司]、Moshot MSX2型倒置显微镜（广州市明美光电技术有限公司）、Infinite M200型酶联检测仪（瑞士TECAN公司）、CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）、Agilent 6890N型气相色谱仪（美国Agilent公司）、GL-3250C型磁力搅拌器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）和移液器（德国Eppendorf公司）。

1. 2 对硫磷抗原合成及单克隆抗体制备

1. 2. 1 对硫磷半抗原、完全抗原合成及鉴定 参照Xu等（2011）的方法合成半抗原，其结构式为：4-（二乙氧基硫代磷酸酯基）苯甲酸[4-（diethoxyphosphorothioyloxy） benzoic acid]，如图1-A所示。采用活泼酯法（Xu et al.，2009）将半抗原偶联到载体蛋白上，其中免疫抗原采用的载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA），包被抗原则采用卵清白蛋白（OVA）作为载体蛋白。完全抗原的合成结构如图1-B所示，所有偶联物均采用紫外吸收光谱进行扫描鉴定。

1. 2. 2 免疫方案及小鼠血清效价测定 使用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）将对硫磷免疫抗原稀释至1.0 g/L。免疫方案如表1所示，将完全弗氏佐剂与等体积的免疫抗原混合，充分乳化，对5只7周龄Bal b/c雌性小鼠进行初次免疫，每只小鼠免疫剂量为200 μL，免疫部位为背部皮下或腹腔。第3次免疫后第7 d，对小鼠进行眼周采血，离心后分离血清。用ic-ELISA检测小鼠血清效价，效价定义为吸光值（A）为1.00时抗血清最大稀释倍数，选取效价最高的小鼠为融合小鼠。融合前4 d对小鼠进行加强免疫。

1. 2. 3 细胞融合与单克隆抗体筛选 在50% PEG- 2000作用下融合小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0（细胞数目比值约10∶1）9～11 d，以间接酶联免疫方法（i-ELISA）评价融合细胞株的阳性，再采用ic-ELISA筛选特异性强的细胞株，抑制孔的对硫磷浓度设为300 ng/mL，最终通过有限稀释法进行细胞单克隆化处理，得到稳定分泌特异性识别对硫磷的杂交瘤细胞株。

1. 2. 4 单克隆抗体制备及纯化 制备腹水前1周，选取5只7周龄Balb/c雌性小鼠，注射0.5 mL无菌石蜡油破坏其免疫系统，随后将1.2.3筛选所得单克隆细胞株进行扩繁，制备腹水。1周后留心观察小鼠，当发现小鼠腹腔部位明显膨大后可收集腹水。将腹水静置约4 h后，3000 r/min离心10 min，除去脂肪层和细胞层，仅收集中间澄清液，再用饱和硫酸铵法（朱立平和陈学清，2000）纯化澄清液，蒸馏水透析后冻干，即得纯化单克隆抗体。

1. 3 对硫磷ic-ELISA建立

1. 3. 1 抗原抗体最佳工作浓度筛选 采用ic-ELISA，通过棋盘格试验对包被抗原和抗体的最佳工作浓度组合进行筛选，即选定在492 nm下测定吸光值时，可实现A492 nm在1.00以上，抑制率高于90%的包被抗原和抗体组合即为最佳工作浓度组合。

1. 3. 2 标准曲线建立 采用ic-ELISA对系列浓度的对硫磷标准溶液进行检测，以抗原抗体的结合率（B/B0）为纵坐标、对硫磷系列浓度为横坐标，建立对硫磷ic-ELISA标准曲线。

1. 3. 3 特异性分析 在相同工作条件下，采用ic-ELISA建立对硫磷及与其结构类似的有机磷农药（丙溴磷、杀扑磷、倍硫磷、水胺硫磷和甲拌磷）的标准曲线，通过计算IC50分别求出对硫磷单克隆抗体与各有机磷农药的交叉反应率，计算公式为：交叉反应率（%）=IC50（对硫磷）/IC50（有机磷农药）×100。根据算得的交叉反应率对所建立的对硫磷ic-ELISA特异性进行评估。

1. 3. 4 基质效应影响和方法准確性分析 为考察不同浓度基质对ic-ELISA准确性的影响，取空白西红柿样品，参照NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》进行前处理。为获得一系列含不同浓度基质的缓冲液，提取样品经氮气吹干后，用PBS缓冲液将基质稀释至目标倍数（5×、8×和10×），并利用各稀释倍数的基质缓冲液将对硫磷标准品分别稀释为25、50和75 ng/mL 3个标准浓度后进行添加回收试验，测定不同浓度基质缓冲液中添加对硫磷的含量，计算添加回收率。选择对方法性能影响最小的稀释倍数进行方法建立，再按上述方法提取两份等量西红柿样品进行第2次对硫磷添加回收试验，一份以ic-ELISA进行检测，一份以气相色谱法（GC）进行检测，将两种方法的测定结果进行比较，以验证ic-ELISA的准确性。

添加回收率（%）=（样品实测添加浓度-对照空

白添加浓度）/样品实测添加

浓度×100

1. 3. 5 GC测定对硫磷含量 GC条件：毛细管色谱柱型号DB-1701（30 m×530 ?m×1.0 ?m），固定液为DB-35;检测器温度250 ℃，进样口温度220 ℃;载气为氮气，恒压不分流，流量10.0 mL/min，氢气75.0 mL/min，空气100 mL/min，柱温采用程序升温：初始温度150 ℃，以10 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，再以15 ℃/min升至250 ℃，保持2 min;进样量1.00 ?L。

2 结果与分析

2. 1 人工抗原鉴定结果

将载体蛋白BSA、OVA、合成半抗原及偶联产物分别用PBS缓冲液调整浓度至1.0 mg/mL后，进行紫外吸收光谱扫描。如图2所示，对硫磷合成半抗原Hapten-PA、BSA和OVA的最大吸收峰分别在283、285和286 nm处;免疫抗原PA-BSA、包被抗原PA-OVA的吸收曲线与相应的半抗原及载体蛋白相比，均发生明显改变;PA-BSA和PA-OVA与各自载体蛋白相比，在283～286 nm最大吸收峰的吸光值明显不同，表明人工抗原合成成功。

2. 2 融合小鼠的筛选结果

在融合前4 d进行小鼠血清效价与抑制率检测，筛选效价高、抑制好的小鼠加强免疫。由表2可知，融合小鼠的血清效价为8×103，当包被抗原PA-OVA（1.0 mg/mL）按1∶2000稀释、血清按1∶4000稀释时，该融合小鼠血清对100 ng/mL对硫磷的抑制效率可达50%，因此选择该稀释浓度下的抗原抗体组合进行后续细胞筛选。

2. 3 单克隆抗体的制备结果

加强免疫后，将小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合处理9～11 d，用i-ELISA筛选阳性细胞孔，每孔中包被抗原的浓度为0.5 μg/mL。经初检发现，有13个融合孔表现出较强的阳性（表3）。对选取的13个强阳性孔进行抗对硫磷特异性检测，挑选抑制率高的孔，用有限稀释法对其进行多次克隆，最终筛选出1株效价较高、特异性最优的单克隆杂交瘤细胞株，将其命名为4F11A10（图3）。扩大培养该细胞株，制备腹水后用饱和硫酸铵法纯化抗体。

2. 4 最佳抗原抗体工作浓度的筛选结果

由表4可知，当包被抗原PA-OVA稀释500倍（2 μg/mL）、抗体稀释4000倍（0.25 μg/mL）时，对照孔的吸光值A492 nm在1.00以上，且抑制孔的抑制率高于90%，为建立标准曲线的最佳抗原抗体工作浓度组合。

2. 5 ic-ELISA检测对硫磷的标准曲线

以对硫磷系列浓度为横坐标、抗原抗体结合率为纵坐标，经Logit函数拟合得到标准曲线（图4），4F11A10分泌的抗体IC50为50 ng/mL，检测范围IC20～IC80（抑制率为20%～80%的对硫磷浓度）为2.34～300 ng/mL，相关系数为0.9999。说明本研究的对硫磷半抗原结构设计合理，通过人工抗原的成功合成及免疫，能制备出与对硫磷分子特异性结合的抗体。

2. 6 特异性分析结果

选取对硫磷的结构类似物丙溴磷、杀扑磷、倍硫磷、水胺硫磷和甲拌磷，考察所建立检测方法的特异性。由表5可知，单克隆抗体4F11A10与其他结构类似物均无交叉反应，表明以该单克隆抗体可建立特异性针对对硫磷的ic-ELISA。

2. 7 实际样品检测结果

本研究目标开发的对硫磷酶联免疫试剂盒，主要提供特异性针对农产品中对硫磷残留的快速检测方法。向实际蔬菜样品中添加对硫磷，其添加回收率能反映该检测方法的准确性，但不同浓度基质对ic-ELISA的准确性存在影响。可利用背景干扰排除试验确定ic-ELISA检测样品的最佳稀释倍数。

从广西南宁市本地市场购回的西红柿样品经GC检验不含对硫磷。采用ic-ELISA测定并绘制标准曲线，根据标准曲线计算系列不同浓度基质缓冲液背景下（目标稀释倍数為5×、8×和10×），每份西红柿样品的实测添加浓度值，再计算添加回收率。结果如表6所示，在5×、8×和10×稀释倍数下的添加回收率为71.35%～107.69%，表明3个稀释倍数下的基质背景均满足ic-ELISA对准确度和精密度的要求。当基质缓冲液的目标稀释倍数为8×时，对硫磷的添加回收率范围在71.35%～96.10%，更接近100.00%，故选择该稀释倍数进行第二轮对硫磷添加回收试验，同时采用GC进行验证。结果如表7所示，ic-ELISA检测对硫磷的回收率为84.86%～100.27%，加标样品经GC验证的回收率为97.60%～106.40%，两种方法检测结果一致性好，表明所建立的对硫磷ic-ELISA对农产品安全监督具有良好的实用性。

3 讨论

本研究所用的半抗原4-（二乙氧基硫代磷酸酯基）苯甲酸是以O，O-二乙基硫代磷酰氯与4-羟基苯甲酸反应制取，随后选择保留乙氧基磷酸酯和芳香环，利用苯环对位上的羧基偶联载体蛋白制备免疫抗原和包被抗原。所制备的单克隆抗体4F11A10与丙溴磷、杀扑磷、倍硫磷、水胺硫磷和甲拌磷均无交叉反应，特异性好。李盼等（2017）同样利用4-（二乙氧基硫代磷酸酯基）苯甲酸作为半抗原，偶联载体蛋白血蓝蛋白合成完全抗原免疫小鼠，所制备的单克隆抗体可广谱性识别14种O，O-二乙基类有机磷农药，但对每种农药的特异性不同;其对对硫磷的IC50为0.165 μg/mL（交叉反应率为1134%），对丙溴磷的IC50为2.583 μg/mL（交叉反应率为72%），对甲拌磷的IC50为5.578 μg/mL左右（交叉反应率为33%）。虽然都是通过同样的半抗原结构偶联载体大蛋白分子制备完全抗原，但本研究在单克隆细胞株筛选的初期，除了检测融合细胞孔的阳性，同时采用ic-ELISA检测阳性杂交瘤细胞孔的特异性，即设置多个抑制孔，分别添加不同对硫磷类似物以检测抗体的识别效应。为确保所得单克隆细胞株具备强特异性，将与对硫磷类似物存在交叉反应的细胞融合孔舍弃，因此本研究与李盼等（2017）分别筛选获得具备不同特异性的对硫磷单克隆抗体。除了可在单克隆细胞株筛选阶段提前检测与目标检测对象结构类似物的交叉情况，以提高抗体的特异性，还可通过在通用半抗原的基础上引入取代基来提高有机磷农药单克隆抗体的特异性。Piao等（2009）在半抗原4-（二乙氧基硫代磷酸酯基）苯甲酸的基础上，在苯环的间位加入1个取代基，制备的抗体对毒死蜱、杀螟松和二嗪哝等间位有取代基的农药具有较强的特异性。

当前市场上针对农产品中对硫磷的残留检测大多仍采用仪器检测手段，虽然已有相关研究报道了对硫磷ELISA的摸索及建立（李盼等，2017;李晓丽等，2017），但均未见相关方法的后续推广与应用。本研究筛选获得对硫磷特异性单克隆抗体，建立对硫磷ic-ELISA，并采用ic-ELISA和GC同时进行西红柿样品中对硫磷的添加回收试验，实现ic-ELISA方法灵敏度及准确性的验证。该方法的建立将填补广西农产品市场上对硫磷农药残留快速免疫检测技术的空白。进一步利用该抗体开发基于胶体金颗粒的对硫磷免疫层析试纸条（Liu et al.，2018），还可实现批量农产品对硫磷残留的现场快速初筛工作。

4 结论

利用半抗原4-（二乙氧基硫代磷酸酯基）苯甲酸偶联载体蛋白合成完全抗原，免疫小鼠获得抗对硫磷特异性单克隆抗体并建立对硫磷ic-ELISA，该方法可用于快速检测蔬菜、水果等农产品中的对硫磷残留。

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（責任编辑 罗 丽）