藤茶双氢杨梅树皮素联合环磷酰胺抗肿瘤作用研究

潘翠柳，陆小莲，吴捷梅，黄裕华，唐云丽，梁臣艳，郑作文，黄美玲

（广西中医药大学，广西 南宁 530200）

恶性肿瘤是人类面临的重大难题，已经成为影响我国居民健康及威胁生命的疾病之一［1-3］。化疗药物在治疗恶性肿瘤方面具有重要的地位，但化疗药物具有较大的毒副作用［4］。因此，寻找高效低毒的抗肿瘤药物和对化疗药具有减毒增效作用的辅助药物成为目前研究的热点。

藤茶系葡萄科蛇葡萄属植物显齿蛇葡萄Ampelop⁃sis grossedentata（Hand.-Mazz.）W.T.Wang，主要用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、黄疸型肝炎等病症［5］。其主要成分双氢杨梅树皮素（APS）是该植物中含量最高的黄酮类化合物［6］，多项研究表明，APS具有抗炎镇痛［7-8］、抗肿瘤［9-13］、降血糖及降血脂［14-15］、抗氧化［16］、抗过敏［17］、抗粥样硬化［18-19］、保肝［20-21］等药理作用。基于前期研究基础，本文建立H22荷瘤小鼠模型，探讨APS对化疗药环磷酰胺（CTX）抗肿瘤的增效减毒作用，为后续深入研究藤茶黄酮类化合物及临床应用提供进一步的科学依据。

1 实验材料

1.1 动物 健康SPF级昆明种小鼠，体质量18～22 g，雌雄各半，购自广西医科大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（桂）2009-0002。

1.2 细胞株及试药 H22细胞由广西中医药大学科学实验中心提供；双氢杨梅树皮素（由贵州苗药生物技术有限公司生产，批号：DH20180712）；环磷酰胺（CTX，由山东西亚化学股份有限公司生产，批号：ZB98974）；RPMI 1640培养基［由赛默飞世尔（苏州）仪器有限公司生产］；胰蛋白酶-EDTA消化液（由北京索莱宝科技有限公司生产，批号：SLBT1300-100）。

2 实验方法

2.1 H22原代细胞的培养 取H22细胞适量，用生理盐水稀释为 1×107～10×107个/ml，取 0.2 ml H22细胞皮下注射接种在小鼠右腋窝，小鼠自由成长至瘤体积大于500 mm3时，开始准备剥瘤，进行原代培养。采用无菌操作取出瘤体，取下瘤体组织以后，加入PBS缓冲液清洗干净，去外周组织后用消毒剪刀剪成1～2 mm3小块，加入不含血清的RPMI 1640培养液研磨，离心（1 000 r/min，5 min），弃上清液后，加入胰酶消化2 min，终止消化，过200目的细胞筛，离心（1 000 r/min，5 min），加完全培养液轻轻吹散均匀制成细胞悬液。

2.2 动物分组及给药 无菌条件下取小鼠H22原代培养的瘤细胞，用生理盐水稀释瘤细胞浓度为5×106个/ml，于小鼠右腋窝皮下接种瘤液，每只0.2 ml；接种后每日观察小鼠接种部位肿瘤生长情况，并用游标卡尺测量小鼠的瘤体积，瘤体积大小为500 mm3时，显示小鼠造模成功，选出皮下瘤体积生长大小接近的荷瘤小鼠，随机分为6组：模型对照组、环磷酰胺组、APS高剂量组、APS低剂量+环磷酰胺组、APS中剂量+环磷酰胺组、APS高剂量+环磷酰胺组，每组14只。环磷酰胺组予环磷酰胺溶液灌胃，剂量为0.02 g/kg，容积为10 ml/kg；APS高剂量组予双氢杨梅树皮素溶液灌胃，剂量为0.60 g/kg，容积为10 ml/kg；APS低剂量+环磷酰胺组：灌胃双氢杨梅树皮素溶液0.15 g/kg+腹腔注射环磷酰胺0.02 g/kg，容积为10 ml/kg；APS中剂量+环磷酰胺组：灌胃双氢杨梅树皮素溶液0.30 g/kg+腹腔注射环磷酰胺0.02 g/kg，容积为10 ml/kg；APS高剂量+环磷酰胺组：灌胃双氢杨梅树皮素溶液0.60 g/kg+腹腔注射环磷酰胺0.02 g/kg，容积为10 ml/kg。小鼠每日给药前称量体重，首次给药前先量取瘤体积即为初体积，末次给药后量取瘤体积即为末体积，从而计算出APS联合CTX对H22荷瘤小鼠给药前后肿瘤体积的影响。末次给药后24 h后颈椎脱臼处死小鼠，取血清用于生化检测，取瘤块、脾、胸腺和肝组织并称取重量。

2.3 H22荷瘤小鼠的肿瘤抑制率 按照公式计算各组的抑瘤率，抑瘤率（%）=（模型对照组瘤重-给药组瘤重）/模型对照组瘤重×100%。

2.4 脾指数、胸腺指数及肝脏指数的测定 末次给药24 h后，用眼科镊取出小鼠的脾脏、胸腺和肝脏组织，使用滤纸吸干残血，称重。计算各组脾指数、胸腺指数和肝脏指数。计算公式：器官指数（mg/g）=器官重量（mg）/动物体重（g）。

2.5 数据处理 采用SPSS 24.0软件对数据进行统计学分析，数据以均数±标准差（±s）表示，组间两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 APS联合CTX对H22荷瘤小鼠肿瘤体积的影响 见表1。

表1 APS联合CTX对H22荷瘤小鼠肿瘤体积的影响 （±s）

表1 APS联合CTX对H22荷瘤小鼠肿瘤体积的影响 （±s）

注：与模型对照组比较，①P＜0.05，②P＜0.01；与CTX组比较，③P＜0.05，④P＜0.01；下同

组 别 剂量（g/kg） 初瘤体积（mm3） 末瘤体积（mm3） 瘤体积差（mm3）模型对照组CTX组APS高剂量组APS低剂量+CTX组APS中剂量+CTX组APS高剂量+CTX组动物数开始14 14 14 14 14 14结束11 13 12 13 14 14——0.02 0.60 0.15+0.02 0.30+0.02 0.60+0.02 676.55±118.59 706.92±168.83 655.42±93.96 698.38±121.33 700.50±226.39 668.36±130.37 7 492.27±2 413.04 5 624.54±2 028.83 5 377.50±2 139.47 4 474.92±1 652.37 4 436.64±1 834.15 3 493.14±1 073.88 6 815.73±2 358.57 4 917.62±1 920.66①5 307.67±3 066.08 3 776.54±1 604.74②3 736.54±1 836.44②2 824.79±1 045.71②④

表1结果显示，与模型对照组比较，除APS高剂量组瘤体积差变化不大外，其余用药组瘤体积差均明显减小，具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与CTX组比较，APS高剂量+CTX组的瘤体积差减小更明显，具有显著性差异（P＜0.01）。

3.2 APS对CTX抑瘤的增效作用 见表2。

表2 APS对CTX抑瘤的增效作用 （±s）

表2 APS对CTX抑瘤的增效作用 （±s）

组 别 动物数 剂量（g/kg） 平均瘤重（g） 抑瘤率（%）模型对照组CTX组APS高剂量组APS低剂量＋CTX组APS中剂量＋CTX组APS高剂量＋CTX组开始14 14 14 14 14 14结束11 13 12 13 14 14——0.02 0.60 0.15＋0.02 0.30＋0.02 0.60＋0.02平均体重（g）开始28.99 29.85 28.06 27.63 28.30 27.76结束32.63 32.78 30.25 28.14 29.81 28.20 5.07±2.71 3.37±0.94①4.02±1.41①2.69±1.19①③2.61±0.94②③2.02±0.43②④33.57 20.72 47.07 48.52 60.26

表2结果显示，与模型对照组比较，各用药组瘤重均明显减轻，具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；单用藤茶双氢杨梅树皮素高剂量组抑瘤率为20.72%，单用CTX组抑瘤率为33.57%，藤茶双氢杨梅树皮素低、中、高剂量组与CTX联用后抑瘤率分别为47.07%、48.52%和60.26%；与单用CTX组比较，联合用药组的平均瘤重显著减轻，明显提高了对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用（P＜0.05或P＜0.01）。

3.3 APS对CTX抑瘤的减毒作用 见表3。

表3 APS对CTX抑瘤的减毒作用 （±s）

表3 APS对CTX抑瘤的减毒作用 （±s）

组 别 剂量（g/kg） 脾指数（mg/g） 胸腺指数（mg/g） 肝脏指数（mg/g）模型对照组CTX组APS高剂量组APS低剂量+CTX组APS中剂量+CTX组APS高剂量+CTX组动物数开始14 14 14 14 14 14结束11 13 12 13 14 14—0.02 0.60 0.15+0.02 0.30+0.02 0.60+0.02 0.70±0.32 0.37±0.13②0.65±0.23④0.47±0.15①0.49±0.17①③0.54±0.17④1.47±0.07 0.64±0.12②1.17±0.21②④1.01±0.13②④1.05±0.10②④1.34±0.08④50.33±4.82 44.14±13.73 59.23±13.26③55.32±10.62 55.54±5.47 63.61±6.50①④

表3结果显示，与模型对照组比较，CTX组脾指数和胸腺指数明显下降，具有统计学意义（P＜0.01）；与CTX组比较，APS中、高剂量与CTX联合用药后可提高小鼠的脾指数和胸腺指数，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；APS低剂量与CTX联合用药后可明显提高小鼠的胸腺指数（P＜0.01）；APS高剂量与CTX联合用药后还可明显提高小鼠的肝脏指数（P＜0.01）。

4 讨 论

恶性肿瘤是危及人类生命的主要疾病之一。化疗已成为肿瘤综合治理的重要手段之一，但化疗药物具有一定的毒副作用，常见的有消化障碍、骨髓障碍、脏器功能衰弱、过敏等症状［22］。中药因具有较好的疗效且副作用少，已受到国内外研究者的广泛关注。大部分中草药可通过提高机体的免疫系统、减轻肿瘤对机体的损伤作用，从而达到增效减毒的作用。

藤茶在我国瑶族、壮族地区已有数百年的应用历史［23］，民间用于治疗感冒、肠胃不适、肝病等，大量实验已证实，藤茶的有效成分在体内外对H22细胞［13］、S180细胞［24］、人肝癌［25］等肿瘤细胞的增殖、转移、凋亡均具有明显的抑制作用。本文通过建立H22荷瘤小鼠模型，观察APS与常用抗癌药物环磷酰胺联合应用的效果，并初步分析其可能的作用机制。实验结果表明，APS的抑瘤率低于环磷酰胺，但对脾、胸腺、肝脏指数均有增重的作用；APS联合环磷酰胺对脾、胸腺、肝脏指数有增重作用，且抑瘤率高于单用环磷酰胺，显示APS联合环磷酰胺具有减毒增效作用。

本实验研究结果初步显示，APS联合环磷酰胺防治肝癌具有优势，可为中药联合化疗药物防治肿瘤提供一定的实验依据。考虑到藤茶作用广泛、机制复杂及体内细胞因子的交互作用，其联合增效作用机制还有待进一步的研究考证。