中药冠通方对心梗后心功能不全大鼠心肌细胞PGC-1α和AMPK蛋白的影响

韦 斌，莫雪梅，王 强，姜 浩，叶星江，林洪升，卢健棋

（1.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011；2.武警广西总队医院，广西 南宁 530003；3.广西中医药大学附属国际壮医医院，广西 南宁 530201；4.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

心功能不全是由于各种原因导致心脏泵血功能下降，排血量绝对或相对不足，使血液在脉管运行不畅所致的一种病理状态。早期心功能不全属于无明显症状的心力衰竭，此时心脏发挥代偿功能，如不进行治疗，将发展为有症状的慢性心力衰竭。心肌梗死（简称“心梗”）后心功能不全（简称“心衰”）是临床上心功能不全发生的常见类型［1］。虽然心梗诊疗手段的进步提高了患者的生存率，但是心梗后心衰常导致预后不良，心衰的发病率、死亡率高，是多种器质性心脏病患者几乎不可避免的结局。中医认为心衰的病因病机为本虚标实之证。中药冠通方在临床上治疗心力衰竭有良好疗效［2］，本研究观察中药冠通方对心梗后心衰大鼠心肌细胞过氧化物酶体增殖物活化受体γ辅助激活因子-1α（PGC-1α）和腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）蛋白的影响，探讨中药治疗心衰的机理。

1 实验材料

1.1 动物 SD雌性大鼠，体质量250～320 g，由广西医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（桂）2017-0023；动物饲料由广西医科大学实验动物中心提供，适应性饲养1周。

1.2 药品及主要试剂 冠通方颗粒（由人参、三七、丹参、黄芪、地龙、全瓜蒌、绞股蓝、陈皮等组成），由广西中医药大学附属瑞康医院制剂室提供，规格为每包3.5 g（每克相当于含生药4 g）；卡托普利片（中美上海施贵宝制药有限公司产品，国药准字H31022816，规格：每片25 mg）；PGC-1α（ABCAM公司）；AMPK抗体（ABCAM公司）；二抗（ABCAM公司）；Western blot凝胶试剂盒（碧云天公司）。

1.3 仪器 DW-3000型小动物呼吸机（北京智鼠多宝生物科技有限公司）；DYY-7C型电泳仪（北京六一厂）。

2 实验方法

2.1 心梗后心衰大鼠动物模型的制作 参考文献［3］的造模方法：大鼠予10%的水合氯醛（4 ml/kg）麻醉，麻醉后固定，监测大鼠心电图，无创气管并插管，连接小动物呼吸机进行正压通气，潮气量约7 ml，呼吸频率70次/分钟；呼吸比为2∶1。在胸骨左缘扪及心脏搏动处纵行切开皮肤约2 cm，逐层钝性分离皮下组织、肌肉，剪断第三、四肋间开胸，充分暴露心脏。用生理盐水润湿棉球保护肺脏组织，小心剥离心包膜，在肺动脉圆锥和左心耳之间，以左冠状静脉主干为标志，尽可能找到冠状动脉前降支，于左心耳根部下方5 mm处以2/0缝合针线穿过并结扎左冠状动脉前降支（LAD），以心电图ST段弓背向上抬高大于0.1 mV并持续5 min以上作为结扎成功的标志，最后清除胸腔积血并缝合关闭胸腔。假手术组只穿针线不结扎。

2.2 分组与给药 手术前随机抽取6只大鼠作为假手术组，其余18只大鼠按2.1项方法进行造模。手术3 d后，将心梗后心衰模型大鼠按随机数字表法分为3组：模型对照组、冠通方组、卡托普利组。大鼠分组后分笼饲养，每天早上9点定时灌胃，药物用量根据人-大鼠临床用药剂量换算公式［4］换算成大鼠用药量。假手术组和模型对照组予生理盐水灌胃；冠通方组灌服给予冠通方溶液，剂量为2.5 g/（kg·d）；卡托普利组灌服给予卡托普利溶液，剂量为0.002 5 g/（kg·d）。各组连续给药4周，于末次给药2 h后进行取材。

2.3 标本采集及指标检测 取左室心肌100 mg，提取蛋白后采用Western blot半定量测定。应用非连续梯度SDS-PAGE电泳进行分离（AMPK的分子量约为62 kD，分离胶的浓度为8%；PGC-1α的分子量约为91 kD，分离胶的浓度为8% ；浓缩胶的浓度均为6%）。转入PVDF膜上，先用5%的脱脂奶室温封闭2 h，再分别用抗AMPK或PGC-1α的一抗于4℃孵育过夜。将膜洗涤2遍后，分别用1∶5 000标记有过氧化物酶的羊抗兔或兔抗羊的二抗，37℃孵育2 h。充分洗涤后，加入ECL超敏发光试剂发光，压片时间1 min，测定各条带的灰度值。记录时，各蛋白的表达水平以相应区带的灰度值相对于内参β-actin灰度的比值代表其相对含量。

2.4 统计学方法 统计学处理应用SPSS 21.0统计软件做数据处理分析，数据以均数±标准差（±s）表示，多组间两两比较，用单因素方差分析，以P＜0.05为有显著性差异。

3 结 果

3.1 动物一般情况 心梗后心衰模型大鼠精神萎靡，毛发蓬松，反应迟钝，活动减少，能进食进水，尿量增多，毛色蜡黄、脏乱粗糙。给予青霉素治疗1周后，大鼠一般状态良好，精神恢复，反应灵敏，活动自如，能梳理毛发，毛发颜色逐渐被梳理整洁。

3.2 心肌细胞观察

3.2.1 心肌细胞肉眼观察情况 解剖大鼠可见，造模大鼠的心脏可见残留的线头和纤维化的坏死区，心尖部钝圆略呈球形，横切面可见心腔扩大，未坏死区心肌饱满，心室壁肌层稍厚，坏死区域呈灰白色纤维化膜，失去肌肉组织，从外观上看，心肌细胞可能发生心肌重塑。假手术组心脏大小正常，未见畸形变化。

3.2.2 心肌细胞显微结构 见图1。假手术组心肌细胞形态结构完整，大小相同，肌纤维排列紧密且有序规则。模型对照组部分区域心肌大小不一，排列不规则，心肌细胞梗死区由纤维瘢痕组织代替，坏死区心室壁变薄，坏死区边缘心肌排列松散，不规则，心肌细胞增大，表明大鼠心梗造模成功。冠通方组、卡托普利组均可见心肌细胞代偿性增大，排列整齐，心肌纤维横纹较粗大。

图1 各组心肌细胞显微结构HE染色图 （×200）

3.3 各组PGC-1α、AMPK蛋白表达量比较 见图2、图3和表1。

图2 各组PGC-1α表达条带

图3 各组AMPK蛋白表达条带

表1 各组大鼠心肌组织中PGC-1α、AMPK蛋白表达量比较 （±s）

表1 各组大鼠心肌组织中PGC-1α、AMPK蛋白表达量比较 （±s）

注：与假手术组比较，①P＜0.05；与模型对照组比较，②P＜0.05

组 别假手术组模型对照组冠通方组卡托普利组n 6 6 6 6剂量（g/kg）— —2.5 0.002 5 PGC-1α 0.604±0.018 0.392±0.014①0.535±0.035②0.495±0.053②AMPK蛋白0.876±0.030 0.760±0.047①0.858±0.035②0.810±0.012②

表1结果显示，与假手术组比较，模型对照组的PGC-1α、AMPK蛋白均显著降低（P＜0.05），表明大鼠心梗造模成功；与模型对照组比较，冠通方组和卡托普利组的PGC-1α、AMPK蛋白均显著升高（P＜0.05），提示冠通方和卡托普利可促进心梗后心衰心肌细胞的PGC-1α和AMPK蛋白表达，从而达到保护心肌细胞的作用。

4 讨论

过氧化物酶体增殖物活化受体γ辅助激活因子-1α（PGC-1α）是一种功能强大的转录调节辅助激活因子，能够调节线粒体ATP的合成，刺激线粒体生物合成，促进肝糖原的异生以及脂肪酸β氧化等一系列能量代谢。因此，PGC-1α是心肌细胞能量代谢的一个重要蛋白分子［5-7］。腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）是一种在真核细胞生物中广泛存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶［8］。AMPK激活后，通过影响线粒体生成、蛋白质合成及分解在细胞的生长和分化过程中发挥重要作用［9-10］。研究表明，通过AMPK等途径介导活化PGC-1α，能激活下游的核呼吸因子、线粒体转录因子A，增强心肌线粒体的功能，促进ATP的生成，给心肌细胞提供能量［11-12］。通过促进AMPK等途径而激活PGC-1α，可能是冠通方治疗心力衰竭的靶点。

慢性心衰属祖国医学“喘证”“水肿”等范畴，属本虚标实、虚实夹杂之证［13-15］，慢性心衰的中医病理机制是心气虚乏、运血无力，冠通方正是基于冠心病“正气虚于内，痰瘀血痹于中”之病机认识，采用益气养阴、清热解毒化痰、行气活血、化瘀通络的原则立法遣方，具有益气养阴、清热解毒化痰、行气活血、化瘀通络之功，诸药合用切中病机。现代研究表明，冠状动脉结扎术后导致心肌细胞坏死，坏死区周围的心肌细胞发生凋亡，心功能不全逐渐恶化。冠通方是方显明教授在长期的医疗实践中总结出来的复方制剂［16］。已有的研究表明，绞股蓝对缺血心肌具有保护作用［17］；丹参具有扩张冠状动脉、抗氧化、保护心肌细胞等作用［18］；人参治疗慢性心功能衰竭具有强心、减轻心脏前后负荷、减少心肌对氧的需求量、改善心脏内微循环等作用［19-20］；黄芪可通过抑制磷酸二酯酶和钙调蛋白的活性，减少cAMP的分解，增加钙内流和肌浆网内钙释放，加强心肌细胞兴奋-收缩耦联，产生强心作用，其作用强度与剂量呈正相关［21-22］。许多试验亦证明黄芪具有明显的正性肌力作用，其作用类似非洋地黄类正性肌力药物。

本研究建立心梗后诱发心衰的实验大鼠模型，实验结果表明，PGC-1α和AMPK蛋白在模型对照组中表达明显降低，与假手术组比较差异有统计学意义（P＜0.05），用冠通方和卡托普利片干预后，大鼠心肌细胞PGC-1α和AMPK蛋白表达明显升高，与模型对照组比较有统计学意义（P＜0.05）。提示冠通方可促进心梗后心衰心肌细胞的PGC-1α和AMPK蛋白的表达，从而达到保护心梗后心肌细胞的作用。