桑根酮D对肿瘤细胞及移植瘤生长作用研究

王 艺，魏 华，杨 光，张 梅

石河子大学药学院 新疆植物药资源利用教育部重点实验室，新疆石河子 832000

癌症，又称恶性肿瘤，是严重危害人类健康、导致现代人类死亡的第一大恶疾和顽症。近20年，我国的恶性肿瘤发病率和死亡率呈逐年上升趋势，目前国内多数肿瘤患者，以中晚期居多，治愈率较低。世界卫生组织调查结果显示，在世界范围内恶性肿瘤死亡率呈现持续上升的趋势。虽然对细胞癌变机制的认识在不断深入，然而人们在控制癌症的征途中步履维艰，进展缓慢，人类将面临着防治恶性肿瘤的新挑战[1]。恶性肿瘤的治疗方法早期多以手术为主，但大多数患者发现时已为晚期，失去了手术切除的机会。放疗等其他方法疗效均不理想，且副作用大。所以，临床上药物治疗仍为多数病人不可缺少的治疗手段。因此，寻找新的抗癌药物并探讨其分子机制是目前癌症防治措施的研究重点。

桑树中有抗癌作用的黄酮类化合物，其特有的Diels-Alder型加合物，以桑根酮D(sanggenon D)含量较高。药理学研究证实该单体具有明显的降压、抗炎作用，但其抗癌作用研究鲜有报道。目前，国外仅证明这种化合物对PKC、ODC和COX-1等癌症相关因子有抑制作用，国内主要研究该单体的提取工艺[2-5]。本课题前期的实验结果显示，桑根酮C(是桑根酮D的同分异构体)能抑制多种人肿瘤细胞，尤其对肝癌细胞最为敏感[6]。本研究开展了桑根酮D体内外抗癌活性的研究，旨在探究桑树中抗癌活性成分，发现更好的抗癌药物，为药用植物黑桑的开发和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器

二氧化碳细胞培养箱(Thermo 3131)，超净工作台(ZHJH-1112B)，蔡司荧光倒置显微镜(MIC00266)，酶标仪(Thermo 3001)，普通生物倒置显微镜(BDS200-PH)，电子天平(AR-2140 型)，MH-2微量振荡器，HH.S精密恒温水浴锅，离心机(TGL 16 M)，超声波清洗器，电热恒温鼓风干燥箱，超低温冰箱，4 ℃冰箱等。

1.2 样品与试剂

桑根酮D(英文名称：sanggenon D；纯度：HPLC>98%；CAS号：81422-93-7；分子量：708.70；分子式：C40H36O12；产品货号：HS052274，购于宝鸡市辰光生物科技有限公司)，5-氟尿嘧啶(美仑生物)，1640(HyClone)，PBS，0.4%SRB溶液，胰蛋白酶(BOSTRE)，小鼠黑色素瘤B16F0细胞、小鼠黑色素瘤B16F10细胞、人肝癌HepG2细胞(中科院上海细胞库)，小鼠肝癌细胞H22细胞株(北京协和细胞资源库)，昆明种(KM)小鼠(石河子大学实验动物中心)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

用含10%血清和1%双抗的RPMI1640培养液，在37 ℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养人肝癌HepG2细胞、小鼠黑色素瘤B16F0细胞、B16F10细胞。

1.3.2 细胞增殖测定

将对数生长期的B16F0细胞、B16F10细胞、HepG2细胞分别按照2×104、3×104、8×104个/mL浓度接种于96孔板(180 μL/孔)，24 h后，加入不同浓度的桑根酮D和5-FU处理细胞，48 h后采用SRB法检测细胞增殖情况。

1.3.3 黑色素含量的测定

按照Vandana法，将对数生长期的B16F0、B16F10细胞以1.0×105个/孔铺于6孔板中，加入三个浓度的桑根酮D(20、40、80 μmol/L)，24h后，PBS洗2次，用0.25%的胰酶消化收集于离心管，再次用PBS洗一次并倒入离心管，3 500 rpm离心5 min，收集上清液，取1 mL上清液加入1 mL 0.4 M HEPES buffer(pH 6.8)和1 mL乙醚∶乙醇=1∶1(V∶V)，取下层水相，于405 nm测定细胞外吸光度(A)；取细胞沉淀，细胞计数后加入含10%DMSO-NaOH 1.5 mL于80 ℃煮1 h，3 500 rpm离心10 min，取上清液，于405 nm测定细胞内吸光度(A)。

1.3.4 细胞克隆形成实验

取对数生长期的B16F0、HEPG2、B16F10单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，将B16F0、HEPG2细胞悬浮在含10%胎牛血清的1640培养液中备用，B16F10悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。将细胞以每孔100个/mL的浓度接种于6孔板中，24 h后加入不同浓度的桑根酮D(5、10、20、40、80 μmol/L)，置37 ℃、5%CO2及饱和湿度的环境下，静置培养7天。在蔡司荧光倒置显微镜下观察集落形成情况并拍照。终止培养弃去上清，用PBS润洗2次，用甲醇固定10 min后，弃固定液用Giemsa应用染色液染10 min后，用PBS冲洗多余染液，空气干燥。拍照并计算肉眼可见的集落数，最后计算克隆形成率。

1.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡

细胞按5×108/L的密度接种于6孔板内，加入不同浓度的桑根酮D，培养24 h。离心收集细胞1×105～5×105。加入300 μL Binding buffer，再加入5 μL FITC标记的Annexin V，室温混匀并避光30 min，然后加入PI，避光反应5 min。上流式细胞仪进行检测。

1.3.6 对小鼠肝癌细胞移植动物肿瘤生长的影响

取KM鼠，制备H22小鼠肝癌单细胞悬液，每只小鼠腋窝皮下接种2×106个/mL的细胞悬液(0.2 mL/只)。在接种后第一天开始给药，将动物随机分5组，为模型组、5-FU组(20 mg/kg)、桑根酮D低(12.5 mg/kg)、中(25 mg/kg)、高(50 mg/kg)剂量组，连续腹腔注射桑根酮D 10天。末次给药后24h，处死动物，剥离瘤组织并称重，通过计算得抑瘤率。考察桑根酮D对肝癌移植瘤的抑制作用。

1.3.7 对荷瘤小鼠脏器指数的影响

1.3.6 项中，剥离瘤组织后，取小鼠心、肝、肾、脾等脏器并称重，通过计算得脏器指数。考察桑根酮D对荷瘤小鼠各脏器的毒性。

1.3.8 数据分析

2 结果

2.1 桑根酮D对B16F0细胞、B16F10细胞、HepG2细胞增殖抑制作用

SRB检测结果显示(图1A、B、C)，5、10、20、40、80 μmol/L的桑根酮D和5-FU分别作用于B16F0细胞、B16F10细胞、HepG2细胞48h后，细胞增殖均被抑制，且随着桑根酮D和5-FU浓度升高，增殖抑制作用增强。与空白组比较，均有显著性差异(P<0.01)。计算得桑根酮D对B16F0细胞、B16F10细胞、HepG2细胞的IC50分别为26.71±0.2 μmol/L、40.46±0.03 μmol/L、22.61±0.26 μmol/L。此结果表明桑根酮D对HepG2细胞增殖抑制作用最强。

图1 桑根酮D抑制细胞增殖

2.2 桑根酮D促进细胞黑色素生成

处理细胞24 h后，不同浓度的桑根酮D均可使B16F0、B16F10细胞外(图2A、2C)与细胞内(图2B、2D)黑色素生成增加(P<0.01)。生成的黑色素越多，表明细胞的分化程度越高。胞内和胞外的黑色素含量与对照组相比均升高，且成剂量依赖性，可见10、20、40 μmol/L的桑根酮D可以使B16F0、B16F10细胞分化，恶化程度降低。

2.3 桑根酮D抑制细胞克隆

桑根酮D处理B16F0、B16F10细胞后，细胞集落数减少，抑制其生长。从图3A可以看出并计数，B16F0细胞对照组的集落数为71个，5、10、20、40 μmol/L的SD组形成的集落数为43、33、17、15个。从图3B可以看出，B16F10细胞对照组的集落数为88个，5、10、20、40 μmol/L SD组形成的集落数为70、62、45、7个。同样，桑根酮D处理的HepG2细胞实验结果见图3C，对照组集落数64个，而5、10、20、40 μmol/LSD组形成集落数为53、51、29、13个，其形成的集落的个数均少于对照组的克隆数，增殖能力下降，集落形成能力也减弱，说明较高浓度的桑根酮D抑制HepG2生长。

2.4 桑根酮D对HepG2细胞形态的影响

正常组HepG2肿瘤细胞形态规则，大小均匀，细胞核清楚可见，且均呈贴壁生长状态，少有悬浮细胞存在。其他SD各组细胞形态不规则，体积变小，细胞间隙增加，贴壁细胞减少，部分细胞脱落悬浮在培养液中，结果见图4。

2.5 桑根酮D诱导HepG2细胞凋亡

桑根酮D对细胞凋亡的影响(图5a、b、c、d)。5、10、20 μmol/L的桑根酮D处理HepG2细胞24 h后，流式细胞仪检测细胞凋亡率分别为：7.12%±0.98%、8.09%±1.4 %、11.07%±1.17%(图5e)。与阴性对照组比较，三个浓度的桑根酮D诱导细胞凋亡作用具有显著性差异(P<0.05)。

图2 桑根酮D对黑色素瘤细胞中黑色素生成的影响

图3 桑根酮D对细胞克隆的影响

图4 不同浓度的SD对HepG2细胞形态的影响

图5 桑根酮D对HepG2 细胞凋亡的影响

2.6 桑根酮D抑制移植瘤生长

建立小鼠H22肿瘤模型，分为模型组、桑根酮D低剂量组(SD-L，12.5 mg/kg)、桑根酮D中剂量组(SD-M，25 mg/kg)、桑根酮D高剂量组(SD-H，50 mg/kg)和5-氟尿嘧啶阳性组(5-FU，20 mg/kg)，除模型组外其余组腹腔注射给药。桑根酮D对小鼠的体重影响不大(图6)，与空白对照组相比无显著性差异，说明桑根酮D对小鼠的生长无明显影响。高中低三个剂量组的桑根酮D均具有抑制肿瘤生长作用(图7和图8)，且在该剂量范围内呈现一定的量效关系(表1)。桑根酮D对小鼠H22肿瘤的抑制率为32.51%～45.72%。

表1 桑根酮D对小鼠H22肿瘤的抑制作用及其对荷瘤小鼠生长的影响

注：与空白对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。

Note:Compared with control,*P< 0.05;**P<0.01.

图6 桑根酮D对荷瘤小鼠生长的影响

2.7 桑根酮D对小鼠脏器的毒性研究

肝脏指数结果显示(图9)，桑根酮D组均小于阳性对照组和模型组，与空白组相近。对于肾脏指数，与模型组比较，中、高剂量桑根酮D具有显著性差异(P<0.05)。桑根酮D对心脏的影响(图10)，与模型组比较，中、高剂量桑根酮D组具有统计学意义(P<0.05)；与正常组比较，心脏指数变化不大。脾脏指数变化结果(图10)，高、中、低三个剂量的脾脏指数比正常组大，但比模型组小(P<0.05)。毒理学中，脏器指数增大，表示脏器充血、水肿或增生肥大等，脏器指数减小，表示脏器萎缩及其他退行性改变[5]。由此可见，桑根酮D对小鼠肝脏、脾脏、心脏、肾脏毒性小。

图7 H22异种移植肿瘤组织

图8 桑根酮D对小鼠H22肿瘤的抑制作用

图9 桑根酮D对小鼠肝脏、肾脏的脏器指数的影响

3 讨论

恶性肿瘤严重威胁着人类健康和生命，已成为人类死亡的第一杀手。肝癌是我国高发肿瘤，且死亡率高、救治率低。虽然治疗手段多，但化疗药物是必不可少的。目前临床采用的化疗药物带来的不良反应重、多，而且容易耐药，导致预后效果差。这些现状迫使寻找新的高效低毒的抗癌药物成为防治癌症的重点。

图10 桑根酮D对小鼠心脏、脾的脏器指数的影响

桑白皮(Cortex Mori)是桑科桑属植物MorusalbaL.的干燥根皮。为中国药典收载的常用中药之一，具有泻肺平喘、利水消肿功效。现代药理研究表明，桑白皮降糖降脂主要药效成分为桑白皮黄酮、生物碱及多糖类成分[9]，而桑根酮D和桑根酮C是桑树中特有的黄酮结构，在桑黄酮中含量高[6-8]。桑白皮具有抗癌、抗炎、降血压、降血糖、和抗动脉粥样硬化等药理作用，临床可用于治疗前列腺癌、“三高”等疾病[10-13]。机制研究发现桑白皮的甲醇提取物可抑制 NF-κB 而诱导人宫颈癌细胞的凋亡，而且可以靶向杀灭肿瘤干细胞[14,15]。

本研究发现桑根酮D抑制B16F0细胞、B16F10细胞、HepG2细胞增殖，桑根酮D对人肝癌HepG2细胞最为敏感。通过用肝癌细胞动物模型来考察SD体内抗癌作用，发现桑根酮D具有抑制移植瘤生长的作用。这些结果显示，桑根酮D具有体内外抗肝癌的作用。而桑根酮D 对小鼠脏器指数的影响比模型组的要小，也比阳性对照组5-FU对各脏器指数小。表明桑根酮D对小鼠脾脏、心脏、肾脏毒性小。本研究说明桑根酮D作为抗癌候选化合物，具有毒性小的优势。

此外，桑根酮D促进B16F0细胞黑色素生成，生成的黑色素越多，表明B16F0细胞的分化程度越高，说明桑根酮D能使细胞分化，恶性程度降低，细胞往好的方向发展。结合对黑色素瘤细胞的胞内胞外黑色素含量的测定，黑色素含量是黑色素瘤分化能力的重要标志[16]，药物诱导黑色素瘤细胞分化为较成熟的上皮样细胞的同时，黑色素的生成能力也增加，生成的黑色素越多，表明细胞的分化程度越高[17]，由于B16F0和B16F10细胞分化，其恶性程度降低，细胞会由低分化向成熟细胞分化。有效的诱导分化剂可使细胞的黑色素含量增加2倍以上[18-20]，提示桑根酮D有诱导B16F0和B16F10细胞向正常黑色素样细胞分化的能力。但本研究结果显示，桑根酮D具有诱导细胞分化成正常细胞的能力。本研究还发现桑根酮D具有诱导肝癌细胞凋亡的作用。

本实验只是初步探讨了桑根酮D可诱导细胞分化和诱导细胞凋亡，具体通过的信号转导通路还不清楚，需进一步研究，桑根酮D是否可作为一种有效的辅助手段用于肝癌患者的治疗，还有待更深入的研究。