犊牛睾丸支持细胞分离培养与纯度鉴定

王 雪，王子铭，李晓宇，冯 瑞，张贵学*

（1.黑龙江八一农垦大学 动物科技学院动物遗传育种与繁殖实验室，黑龙江 大庆 163319；2.东北农业大学 动物科学技术学院 动物繁殖实验室，哈尔滨 150030）

支持细胞（sertoli cells，SCs）是睾丸中唯一的体细胞，不仅是生精细胞的载体，为其供给所需营养物质，还能合成与分泌多种免疫保护因子、生长因子和营养因子，对生精细胞起支持和营养作用［1-4］。SCs分泌的转运蛋白、生长因子、调节蛋白、类固醇及其他一些活性物质在精子发生过程中起着重要的调节作用［5］。SCs还为精子流动提供液体环境，参与下丘脑-垂体-睾丸轴的神经内分泌调节，为生精细胞提供高浓度的雄激素环境并维持睾丸局部免疫豁免功能［6］。

关于牛SCs的分离和培养技术国内外均有报道，主要存在分离步骤繁琐、纯度较低且掺有杂细胞、体外培养状态不好等问题［7-10］。为进一步深入研究睾丸SCs的各种功能和发生机制，建立一套稳定的分离纯化和原代培养体系是必要的。试验通过优化现有的犊牛（新生7 d内）睾丸SCs体外快速分离纯化方法，以期建立一种简单、快捷地获得高纯度SCs原代培养的方法及简单易行、可靠的SCs鉴定方法。

1 材料

1.1 试验动物

荷斯坦犊牛（新生7 d内）睾丸组织，由黑龙江省哈尔滨市双城区鸿利血清生产公司屠宰现场提供。新生犊牛睾丸SCs还未成熟，该阶段分离的SCs能够响应激素调节，而且增殖和分化能力较强。将阉割后完整的睾丸组织立即放入含1%青霉素-链霉素的PBS缓冲液中浸泡，然后冷藏或冰上冷冻，立即运回实验室。

1.2 主要试剂

DMEM／F12培养基、胎牛血清（FBS），购自美国Gibco公司；胶原酶Ⅳ和胰蛋白酶，购自美国Sigma公司；二甲基亚砜（DMSO）、TRIZol，购自Invitrogen公司；100×青链霉素（双抗）混合液，购自中国Beyotime公司；Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix去基因组试剂盒、PCR试剂盒，购自日本TOYOBO公司；DAPI，购自美国Roche公司。

DMEM／F12细胞培养基：含有10%FBS与1%双抗，混合后于4℃保存；细胞冻存液：90%FBS与10%DMSO混合配制，现用现配。

RT-PCR引物序列由中国库美生物公司合成，引物信息见表1。

表1 RT-PCR各个基因引物序列、序列号和产物大小

1.3 主要仪器

自动细胞计数仪，购自Invitrogen公司；细胞培养箱，购自Bio-RAD公司；倒置荧光显微镜（型号为IX51），购自日本OLYMPUS公司；琼脂糖凝胶电泳槽，购自北京六一公司；HT8500全自动凝胶成像分析系统。以上仪器均来源于东北农业大学动物科学技术学院动物繁殖实验室。

2 方法

2.1 SCs的分离与培养

2.1.1 分离与纯化 采用两步酶法和差速贴壁法分离纯化SCs。使用镊子将睾丸从PBS缓冲液里迅速取出并用含1%青链霉素的PBS冲洗，然后移入无菌皿中；在超净台内剥去外膜及睾丸纵膈，将曲细精管转移至新皿中并剪碎成肉糜状；把肉糜转移至10 mL离心管中，将1.0 mg／mL胶原酶Ⅳ及50μg／mL DNase 5 mL于34℃水育摇床消化（110次／min）30 min；1 000 r／min离心5 min，倒掉上清液；用2.5 mg／mL胰蛋白酶、50μg／mL DNase于34℃水育摇床（110次／min）消化20 min；向混合物中加入与上一步胰蛋白酶等体积的DMEM培养液终止消化；倒入100μm无菌不锈钢滤网中过滤；收集过滤液置于新离心管中，用DMEM培养液漂洗2次；1 200 r／min离心5 min后弃掉上清液；细胞沉淀重悬于含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM／F12培养液中；在37℃5% CO2条件下孵育培养1.0～1.5 h后将漂浮细胞悬液移至新培养皿中（以除去部分类肌细胞）。将漂浮悬液继续培养4 h，用DMEM／F12培养基多漂洗几次（以去除生精细胞和间质细胞），保留贴壁细胞（大多数SCs已经贴壁）；重新加入DMEM／F12细胞培养基继续培养。

2.1.2 培养与传代 细胞铺满整个皿（60 mm）即可传代，用PBS轻轻洗一下，加入0.25%胰蛋白酶1 mL，37℃孵育3 min，呈单个细胞状态则立即用培养液终止消化，离心后制成细胞悬液，以8×105／cm2的细胞密度进行传代，重新接种于60 mm培养皿中。

2.1.3 细胞冻存 按照FBS、DMSO之比9∶1的比例配制冻存液，现用现配。待细胞铺满整个培养皿后消化细胞，低速离心后用冻存液将细胞重悬，以1 mL的量分至每个冻存管中。先4 ℃放置30 min，然后-20℃放置1 h，再于-80℃放置过夜，最后放入液氮中长期保存。

2.1.4 细胞复苏 从液氮中取出细胞，迅速放置于37℃水浴锅中速溶；在超净台上将细胞反复吹打混匀，加入适量DMEM／F12基础培养基离心5 min（1 000 r／min），弃掉上清液；细胞用新的DMEM／F12培养液均匀铺至培养皿中，于37℃5% CO2条件下孵育，次日观察生长情况。

2.2 SCs形态学观察与纯度鉴定

在显微镜下观察新分离培养的SCs形态和生长状态。将新分离的SCs培养至第3代，制作细胞爬片后进行HE染色。

应用RT-PCR方法检测SCs标志基因的表达，再用免疫荧光方法检测SCs标志蛋白（WT1和Vimentin）的表达，并对SCs纯度进行鉴定。将新分离纯化的SCs提取总RNA，再用RT-PCR方法检测KRT-18、GDNF、SCF、WT1、Bmp4、FSHR、CYR61（肌细胞标志基因）和CYP11A1（间质细胞标志基因）基因的表达。PCR反应程序：94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35个循环。最后将PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳上分离。

将新分离的SCs和培养传代的细胞制作细胞爬片，应用SCs标志蛋白WT1和Vimentin进行免疫荧光染色。步骤：用含0.2% Triton X-100的4% 多聚甲醛（PFA）固定20 min；1%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭30 min；一抗4℃孵育过夜；FITC-荧光二抗（1∶300）室温孵育2 h；DAPI核染2～10 min；镜检；封片和拍照。详细方法参照参考文献［2］，在显微镜下至少拍5个荧光视野。利用Image J软件进行计数。细胞纯度＝阳性染色细胞数／细胞总数×100%。

2.3 数据的统计分析

试验数据采用Image J软件进行计数分析。

3 结果与分析

3.1 SCs的体外培养和形态学观察

3.1.1 倒置显微镜下观察 新分离的原代SCs在倒置显微镜下略显游离状态，SCs体积较小，形态呈圆形颗粒状，折光性强，见图1A。体外培养1周后，显微镜下可见细胞形态呈不规则的梭型并向四周延伸。细胞生长状态良好，见图1B。细胞基本铺成单层，相邻细胞发生交错连接，细胞质中可见较多的颗粒状物质或空泡，细胞折光性减弱，相邻SCs紧密连接，细胞融合成片，铺成膜状单层。

3.1.2 HE染色 HE染色结果表明，睾丸SCs呈长梭状或不规则的多边形，有3～4个突起，胞质完全铺开，被染成红色，有1个或多个圆形或椭圆形的细胞核，表明其增殖能力旺盛，见图2。分离的细胞符合SCs的生物学特征。

3.2 SCs的活力与纯度鉴定

对体外分离纯化的原代SCs进行4%台盼蓝染色，可见细胞存活率均在95%以上。为进一步确定SCs分离纯度，利用RT-PCR方法检测SCs标志基因，包括KRT-18、GDNF、SCF、WT1、Bmp4、FSHR，以及类肌细胞标志基因CYR61和间质细胞标志基因CYP11A1的表达情况。RT-PCR结果见图3。结果均可见KRT-18、GDNF、SCF、WT1、Bmp4和FSHR基因目的条带，但类肌细胞标志基因CYR61也存在表达，间质细胞标志基因CYP11A1不表达。说明分离的SCs中仍存在一些类肌细胞，但不存在间质细胞污染。因此，为了尽量除去类肌细胞，将新分离的睾丸杂细胞悬浮液培养1.0～1.5 h后，把漂浮悬液细胞移至新培养皿中，以达到除去一些类肌细胞的目的。

为进一步鉴定新方法分离的SCs纯度，选择SCs特异性稳定标志蛋白WT1（sertoli cell marker，whole-stage）［4］和Vimentin（sertoli cell marker，whole-stage）［11］进行细胞免疫荧光染色。Vimentin是一种中间丝蛋白，与WT1一样在SCs整个发育过程中连续表达，为SCs提供稳定和可靠的蛋白标记物，其荧光染色结果见图3。WT1主要在原代SCs的细胞核中表达，WT1染色率为（98.7±0.5）%（n＝3）。Vimentin主要在SCs细胞质中表达，形成细胞骨架的一部分，并且主要位于核周围，在周围留下清晰可见的细胞骨架，SCs呈现出不规则的细胞形态特征，见图4。Vimentin蛋白染色率为（98.3±0.5）%（n＝3）。上述结果表明，分离培养后的SCs纯度较高，可用于后续研究。

4 讨论

SCs对维持雄性生殖系统正常功能具有重要作用，表达的多种细胞因子不但可以维持精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）的自我更新（增殖和维持），还具有诱导SSCs分化的作用［5］。SCs还具有吞噬和免疫保护作用，睾丸SCs形成紧密连接，并形成免疫微环境以隔离分化的生精细胞，或者保护移植的细胞或组织免受有害的免疫反应［12］。源自中胚层的SCs可作为再生医学的新型细胞来源，可转化为多电位神经干细胞［13］。这表明SCs在基于细胞的治疗和组织工程中具有广阔的应用前景。

国内外关于牛SCs分离和培养的报道很多，但也存在分离数量少、鉴定方法陈旧、纯度不够高、生长缓慢等一系列问题。本试验对犊牛睾丸SCs原代提取和培养方法进行优化，拟解决新分离SCs的纯度和培养问题。本试验中，两步酶消化法可以获得数量较多的细胞，但如果消化时间和方法掌握不好，细胞活力会受很大影响，培养后会出现大量的死细胞。因此，细胞处理过程中应避免酶消化过度，防止细胞损伤，如过滤过程中禁止搅拌。SCs培养最好选用干细胞培养级的血清。SCs喜欢密集的生长环境，每次传代密度不可过低。本试验中，实验室提取的SCs在体外培养至10代左右增殖进入平台期；RT-PCR结果表明，分离出的未优化的SCs存在类肌细胞污染。应用两步酶消化法获取的新分离睾丸细胞主要包含SCs、生精细胞、类肌细胞和间质细胞。类肌细胞的贴壁能力强，在细胞接种1 h之内就可直接贴壁在未被包被的光滑玻璃平面上，SCs一般在接种的4 h后贴壁，间质细胞则在6 h后贴壁，而生精细胞则不易贴壁，长时间会处于游离悬浮状态。因此，通过优化的酶消化法和差速贴壁法可进一步分离纯化SCs。本试验通过1.0～1.5 h弃掉原来培养皿的办法除去已贴壁的大部分类肌细胞，再用SCs标志蛋白进行荧光鉴定，免疫荧光结果显示WT1和Vimentin的表达均在98%以上。通过优化获得的SCs方法简单易行，细胞形态均匀，体外生长增殖活力旺盛，纯度较高，可为进一步研究提供素材，也可为其他动物SCs的分离培养提供参考。

睾丸SCs具有多种生物学功能，越来越受到研究人员的重视，随着培养技术的完善，关于其如何启动精子发生、如何维持SSCs的自我更新以及如何调节局部免疫活性的机制将逐渐被揭示。牛作为重要的家畜，提高种畜的繁育能力一直是养殖场管理者和技术人员关心的问题。因此，对SCs的研究也会逐渐引起关注。