let-7a通过抑制MAP4K3/MKK4/JNK信号通路减少脑出血大鼠神经元调亡*

杨 慧，万 广，高绚照，柳 毅，王守春

（1新乡市中心医院神经内科，2新乡医学院第一附属医院骨科，河南新乡453100；3吉林大学第一医院，吉林长春130000）

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是脑实质内血管破裂引起的出血，可导致原发性和继发性损伤，是脑卒中最危险的亚型之一。在ICH发生发展过程中，神经元凋亡、星形胶质细胞增殖和少突胶质细胞死亡可引起离子稳态紊乱、水肿、出血、兴奋性毒性、氧化应激和内质网应激等自毁性病理变化，最终导致残疾，甚至死亡[1]。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）通过对靶基因的调控在细胞分化、增殖、凋亡等各种细胞过程中具有重要作用，其独特的表达谱在调节血管疾病中具有重要作用[2]。在细胞中，miRNA控制程序性死亡（凋亡和自噬）；在大脑中，miRNA控制神经元分化和凋亡，如miR-125b、miR-132和miR-128参与调控神经元分化[3]；miR-365和miR-146a、miR-196b等参与神经元凋亡通路调控。在哺乳动物中，miRNA let-7a参与细胞的分化和凋亡，具有抗增殖作用[4]。在神经干细胞中，let-7a在分化过程中高表达[5]，失活可以阻止生长因子缺失的神经元细胞死亡。吴美华等[2]研究发现，在ICH引起的脑水肿中，let-7a下调了0.5倍。在此基础上，本研究将研究let-7a对ICH后神经元凋亡的作用及分子机制，旨在为ICH治疗寻找新的靶点和信号通路。

材料和方法

1 动物

48只健康Sprague-Dawley（SD）大鼠取自新乡市中心医院动物中心，许可证号为SYXK（川）2019-218，体重250～280 g。在温度（25±1）℃、湿度60%的SPF环境下饲养，自由摄食、饮水，昼夜节律12 h。

2 主要试剂和仪器

2.1 实验试剂 let-7a激动剂（agomir）、阴性对照（negative control，NC）agomir、let-7a拮 抗 剂（antagomir）、NC antagomir、let-7a模拟物（mimic）和 NC mimic由百奥迈科生物技术有限公司提供；Ⅶ型胶原酶、LipofectamineTM2000和PVDF膜购自Invitrogen；DMEM培养基（Yaji，PM150210）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA；PC0001）、20× TBS（T1080）和HE染色试剂盒（G1120）均购自Solarbio；甲醛（SSBT，SS24273）；PBS（联迈生物，LM0221 A）；microRNA荧光定量PCR试剂盒（KALANG，KL190）；蛋白酶K溶液（源叶，R21066）；二甲苯（古朵，GD-RY1215-12）；TRIzol LS试剂（Invitrogen，10296010）；2× SYBR Green qPCR Master Mix（Labio，LBS201）；水合氯醛（经科，JKLN006718）；TdT酶缓冲液（JR01891）和TdT酶反应液（JR01888）均购自上海君瑞；Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega，E1910）；抗 phospho-SAPK/JNK（Thr183/Tyr185）抗体（9255）、抗丝裂原活化的蛋白激酶激酶激酶激酶3（mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 3，MAP4K3）抗体（92427）、抗 phospho-SEK1/MKK4（Ser257）抗体（514）、抗胶质细胞原纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体（80788）、抗 cleaved PARP（Asp214）抗体（5625）和cleaved caspase-3（Asp175）抗体（9661）均购自Cell Signaling Technology）。HEK293T细胞（ATCC，CMH010）。

2.2 实验仪器 净化工作台（Boxun，SW-CJ-2FD）；生物显微镜（OLYMPUS，BX43）；恒温培养箱（DAIHAN，WIG-105）；PCR扩增仪（ABI，7900型）；倒置荧光显微镜（Nikon，Ti2系列）。

3 主要方法

3.1 ICH建模 随机选取40只SD大鼠注射10%水合氯醛麻醉，置于俯卧位，固定于立体定向架上。用牙钻（颅骨前0.2 mm、中线靠右3 mm）钻出一个1 mm的小孔，微量进样器缓慢垂直进针5.6mm，定位于近内囊的苍白球内。将2 μLⅦ型胶原酶（0.5 UⅦ型胶原酶用2 μL生理盐水稀释）以0.4 μL/min的速度注入，留针5min后缓慢拔出，ICH模型构建成功。剩余8只SD大鼠作为假手术（sham）组。

3.2 分组及处理 将造模后的ICH大鼠随机分为5组：model组、let-7a agomir组、NC agomir组、let-7a antagomir和NC antagomir组，每组8只。在侧脑室钻一个1 mm的毛刺孔（颅骨后0.8 mm，中线右侧1.5 mm，4.5 mm 深的位置），将 10 μmol/L的 let-7a agomir、NC agomir、let-7a antagomir和NC antagomir以0.5 μL/min的速度各注射5μL。造模7 d后，由3名不知情观察人员对所有大鼠的神经功能进行评分。评分标准由运动、感觉、反射和平衡测试组成，参照Zea-Longa的分级标准进行评分。计算平均值和标准差。实验过程中各组均无动物死亡。

3.3 细胞的培养和转染 将HEK293T细胞培养在含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM中，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中进行培养。根据LipofectamineTM2000说明书，转染前将细胞以每孔5×105细胞的密度接种于6孔板，孵育过夜。将let-7a mimic或NC mimic转染到HEK293T细胞，培养24 h后进行后续实验。

3.4 HE染色观察病理损伤 取大鼠血肿周围脑组织，制作为10 μm厚的切片，每个实验组选取5个切片，进行HE染色分析。根据HE染色试剂盒说明书进行染色。首先固定切片，冲洗，并用苏木精和伊红染色。切片在梯度乙醇下逐渐脱水，充分干燥，用中性树脂密封，最后在光学显微镜下观察。

3.5 RT-qPCR检测相关RNA相对表达水平 将脑组织在液氮中研磨成粉末，100 mg组织加入1 mL TRIzol LS提取总RNA。使用TRIzol LS试剂提取星形胶质细胞中的总RNA。用分光光度计测定RNA浓度和纯度。将逆转录反应产物与2×SYBR Green Master Mix（Labio）结合，使用ABI 7900型PCR扩增仪扩增，反应体系为10 μL。PCR条件为：95℃10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。循环阈值（cycle threshold，Ct）＞38被定义为无法检测。使用2-ΔΔCt法计算试验组和对照组样品之间的相对倍数变化。每组重复3次。GFAP的上游引物序列为5'-CTCAATGCTGGCTTCAAGGAGA-3'，下游引物序列为5'-GACGCAGCGTCTGTGAGGTC-3'；let-7a的上游引物序列为5'-AGGATCCAAAGGTGGTGGTAAGAGGGTGAT-3'，下游引物序列为5'-AGTCGACATAAGACAAGAAGCAAAAGGTTT-3'；MAP4K3的上游引物序列为5'-GCAAAGCCATCCCAAGTT-3'，下游引物序列为5'-GTGCCTCTATGTTCATTCTGTT-3'；内参照U6的上游引物序列为5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物序列为5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

3.6 Western blot检测相关蛋白的水平 提取各组脑组织蛋白质，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白，然后转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上。在室温下用5%BSA在TBS中封膜1 h。用I抗[GFAP（1∶1 000）、MAP4K3（1∶1 000）、JNK（1∶2 000）、MKK4（1∶1 000）、cleaved caspase-3（1∶1 000）、cleaved PARP（1∶1 000）和 GAPDH（1∶1 200）]在 TBST（TBS中含 0.1%Tween-20）中与PVDF膜4℃培养过夜，然后在室温下与相应II抗孵育2 h。提取40 μg蛋白质用化学发光法进行检测。GAPDH为内参照。最后用蛋白图像处理软件和Quantity One软件分别扫描X胶片和条带灰度。本实验重复3次。

3.7 TUNEL染色检测神经元凋亡情况 断颈处死大鼠，取神经组织制作为10 μm厚的切片，每个实验组选取5个切片，进行TUNEL染色分析。将切片置于染色缸中，用二甲苯洗涤2次，每次5 min；无水乙醇洗涤2次，每次3 min；95%乙醇和75%乙醇3 min各洗1次；用PBS洗涤2次，每次5 min。加入蛋白酶K溶液（20 mg/L）水解20 min，去除蛋白。蒸馏水洗4次。色缸中加入含有2%过氧化氢的PBS，反应15 min；PBS洗涤2次，每次5 min。用滤纸吸去切片上多余液体，添加2滴TdT酶缓冲液放置3 min；用滤纸吸去多余液体，立即添加50～80 μL的TdT酶反应液，37℃孵育1 h；PBS洗涤3次，每次5 min。加入转化剂-POD孵育25 min；PBS洗涤4次，每次5 min。加入5%DBA底物溶液，显色5～10 min；蒸馏水洗涤4次，每次1 min。甲基绿复染10 min，蒸馏水洗涤3次，正丁醇洗涤3次，最后用二甲苯脱水3次，每次2 min。中性树胶封片，在光学显微镜下观察结果。采用ImageJ软件来统计每张图片上的细胞总数（包括凋亡和未凋亡的细胞）和呈现棕黄色的凋亡细胞数。细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

3.8 let-7a与MAP4K3的靶向关系 使用生物信息学软件TargetScan对let-7a和MAP4K3的靶向关系进行预测和分析，并用Dual-Luciferase Reporter Assay System检测萤光素酶活性，进一步验证靶向关系。用PCR扩增含有let-7a结合位点的MAP4K3基因的3'UTR序列。将MAP4K3的3'UTR克隆到pMIR-REPORT萤光素酶载体中，成为pMIR-MAP4K3-WT。通过PCR扩增MAP4K3 3'UTR结合位点的突变，同样克隆到pMIR-REPORT载体中，成为pMIRMAP4K3-MUT。根据LipofectamineTM2000说明书将let-7a mimic/NC mimic和pMIR-MAP4K3-WT/pMIRMAP4K3-MUT共转染到HEK293T细胞中。转染48 h后，用PBS清洗细胞2次，在每孔细胞中加入100 μL裂解缓冲液（Passive Lysis Buffer，PLB），室温下震荡15 min，收集细胞裂解液。取20 μL PLB加入发光板中，用GloMax生物发光检测仪读取背景值；每个样本加入100 μL LAR II工作液，快速混匀、读值；每个样本再加入 100 μL Stop＆Glo Reagent，快速混匀后，放入发光板中检测、读值。每个样本重复3次。

4 统计学处理

用SPSS 22.0进行统计学分析，实验数据用均数±标准差（mean±SD）表示。采用单因素方差分析后，再用SNK-q检验进行各组均数间的两两比较，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 let-7a过表达降低了神经功能评分

利用神经功能评分和HE染色观察病理损伤。结果显示，let-7a agomir组的神经功能评分较模型组和 NC agomir组显著降低（P＜0.05），而 let-7a antagomir组的评分则明显高于模型组和NC antagomir组（P＜0.05），见图1A。RT-qPCR检测大鼠血肿周围脑组织let-7a表达水平显示，let-7a agomir组中let-7a表达水平比模型组和NC agomir组增加了数倍（P＜0.01），而let-7a antagomir组相比模型组和NC antagomir组let-7a表达水平明显降低（P＜0.05），见图1B。从HE染色可以看出，与模型组和NC agomir组相比，let-7a agomir组的病理损伤最轻，而与模型组和NC antagomir组相比，let-7a antagomir组的病理损伤最严重。上述结果表明，let-7a过表达降低了神经功能评分，减轻了脑组织病理损伤。

Figure 1.Protective effect of let-7a over-expression on the rat brain tissues.A：the neurological function score；B：the expression of let-7a was detected by RT-qPCR；C：the brain injury observed by HE staining.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.图1 let-7a过表达对大鼠脑组织的保护作用

2 let-7a过表达降低了GFAP表达水平

由于星形胶质细胞活化是引起ICH的重要原因之一。因此，本研究利用RT-qPCR和Western blot检测星形胶质细胞活化标志物GFAP的表达水平，以判断ICH后的继发性损伤。结果显示，与模型组和NC agomir组相比，let-7a agomir组的GFAP表达水平显著降低（P＜0.05），而let-7a antagomir组却明显高于模型组和NC antagomir组（P＜0.05），见图2。这说明let-7a过表达降低了GFAP的表达水平。

3 let-7a过表达减少神经元凋亡

利用TUNEL染色检测各组神经元凋亡情况；RT-qPCR和Western blot检测let-7a表达水平对ICH后cleaved caspase-3和cleaved PARP蛋白水平的影响。结果显示，let-7a antagomir组TUNEL阳性细胞数明显增加（P＜0.05）；而let-7a agomir组正好相反，阳性细胞数明显减少（P＜0.05），见图3A。let-7a antagomir组cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平明显高于模型组和NC antagomir组（P＜0.05），而let-7a agomir组cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平明显低于模型组和NC agomir组（P＜0.05），见图3B。这些结果表明，let-7a过表达可以减少神经元凋亡，使cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平下调。

Figure 2.let-7a over-expression reduced GFAP expression.A：GFAP mRNA expression level was detected by RT-qPCR；B：GFAP protein expression level was detected by western blot.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs model group.图2 let-7a过表达降低了GFAP的表达水平

4 let-7a和MAP4K3的靶向关系

通过生物信息学软件TargetScan对let-7a和MAP4K3的靶向关系进行预测和分析，结果显示，MAP4K3 3’-UTR的1056～1068 bp区域存在has-let-7a-5p的潜在结合位点，说明MAP4K3是let-7a的靶基因之一，见图4A。将let-7a mimic和NC mimic转染到HEK293T细胞，RT-qPCR检测显示，let-7a组中let-7a的表达显著升高（P＜0.01），MAP4K3的表达显著降低（P＜0.05），说明let-7a过表达抑制了MAP4K3的表达，见图4B。利用双萤光素酶报告基因实验进一步验证let-7a和MAP4K3的靶向关系，结果显示，let-7a mimic组的MAP4K3野生型组萤光素酶活性显著低于突变型组（P＜0.05），说明let-7a和MAP4K3之间的靶向关系为负向调控，见图4C。上述实验结果表明，MAP4K3是let-7a的靶基因之一，且两者为负调控。

5 let-7a靶向MAP4K3抑制MKK4/JNK通路的活化

提取脑组织蛋白，利用Western blot检测MAP4K3、MKK4和JNK的表达水平。结果显示，let-7a agomir组中 MAP4K3、p-MKK4/MKK4和 p-JNK/JNK的蛋白水平明显低于对照组和NC agomir组；let-7a antagomir组的相关蛋白水平显著高于对照组和NC antagomir组（P＜0.05），见图5。这说明let-7a靶向MAP4K3能够抑制MKK4/JNK通路的活化。

讨 论

miRNA的失调与许多人类疾病有关[6]，在大脑中，miRNA参与控制神经元凋亡、程序性细胞死亡过程。let-7a是一种肿瘤抑制miRNA，具有调节炎症小胶质细胞功能[7]，表达模式在小鼠、大鼠和人类的神经分化中比较保守[8]。let-7a在蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤中具有保护作用[9]，可以抑制ICH小鼠促炎细胞因子的表达，减轻脑水肿，改善神经功能[10]。本研究用大鼠ICH模型检测了let-7a的表达水平对大鼠神经功能的影响，结果显示let-7a高表达时，神经功能评分降低，脑组织病理损伤减轻。但let-7a表达水平的调控在ICH发病机制中的作用尚不清楚。

Figure 3.let-7a over-expression reduced neuronal apoptosis and decreased apoptosis-related protein levels.A：the neuronal apoptosis was detected by TUNEL staining；B：the apoptosis-related protein levels were detected by Western blot.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs model group.图3 let-7a过表达减少神经元凋亡并降低凋亡相关蛋白的水平

Figure 4.Targeting relationship between let-7a and MAP4K3.A：the target gene of let-7a was predicted by TargetScan；B：the expression levels of let-7a and MAP4K3 were detected by RT-qPCR；C：targeting relationship was detected by dual-luciferase reporter assay.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC mimic group.图4 let-7a和MAP4K3的靶向关系

Figure 5.let-7a targeted MAP4K3 to inhibit MKK4/JNK pathway activation.The protein expression levels were detected by Western blot.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group.图5 let-7a靶向MAP4K3抑制MKK4/JNK通路的活化

GFAP是一种Ⅲ型中间丝状蛋白，以单体形式存在，是星形胶质细胞活化的标志物。GFAP在大脑发育、细胞凋亡和疾病中有着重要的作用[11]，抑制成熟脑的神经元增殖和神经元突起扩展，形成隔离受损组织的物理屏障，促进血脑屏障[12]。GFAP、cleaved caspase-3和cleaved PARP被认为是脑中不良组织反应的分子标志物和早期指标[13-14]，提示凋亡和神经炎症参与延迟血脑屏障和微血管损伤的机制，导致蛋白质改变[15]。因此，本研究利用RT-qPCR和Western blot检测了let-7a表达水平对ICH后GFAP、cleaved caspase-3和cleaved PARP的影响，并用TUNEL染色检测了神经元凋亡情况。结果显示，let-7a过表达降低了GFAP、cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平，TUNEL阳性细胞数也明显减少，这与之前的研究相似[13-15]，说明let-7a过表达抑制GFAP、cleaved caspase-3和cleaved PARP的水平，减少神经元凋亡。

MAP4K3属于哺乳动物Ste20样丝氨酸/苏氨酸激酶家族，家族成员有MAP4K1/HPK1、MAP4K2/GCK、MAP4K3/GLK、MAP4K4/HGK、MAP4K5/KHS、MAP4K6/MINK 等[16]。MAP4K3在肝癌中参与肿瘤细胞的存活、凋亡和自噬[17-18]；促进胰腺癌[19]、鳞癌[20]和乳腺癌[21]细胞的凋亡，具有抑癌作用。研究发现，MAP4K3在多系统脑萎缩（multiple system atrophy，MSA）中过表达；在黑色素瘤中let-7a通过下调MAP4K3抑制黑色素瘤细胞的生长和侵袭性[22]。但在ICH中没有被提及和研究。因此，本研究利用生物信息学软件对let-7a与MAP4K3的靶向关系进行了预测，进一步用双萤光素酶报告基因实验验证了靶向关系，并将let-7a mimic或NC mimic转染到HEK293T细胞，RT-qPCR检测了MAP4K3和let-7a的表达水平。结果显示，MAP4K3是let-7a的靶基因之一，且两者之间为负调控关系。这与在黑色素瘤中的研究相似[23]，说明let-7a通过下调MAP4K3来抑制ICH后神经元的凋亡。

JNK参与哺乳动物细胞的多种生物学功能，包括凋亡和应激反应[26]。MKK4控制细胞生长和衰老[25]。研究发现，MEKK1通过JNK通路抑制ICH后神经元的凋亡[24]。JNK信号通路在甲状腺乳头状癌中被研究[27]，但在ICH相关疾病中未被提及或研究。为了解MKK4/JNK信号通路在ICH中的分子机制，本研究利用Western blot检测了脑组织MAP4K3、MKK4和JNK的表达情况。结果显示，let-7a过表达降低了MAP4K3、MKK4和JNK的表达。

综上所述，let-7a通过抑制MAP4K3/MKK4/JNK信号通路减轻ICH大鼠的神经元凋亡。这一结果预示let-7a有望成为新的ICH治疗靶点，但其更为详细的分子机制还有待进一步研究。