穿心莲内酯对急性淋巴细胞白血病细胞的生长抑制及凋亡诱导作用*

李晓文，周越菡△，邓健志，罗珍华，江海键，张漫丽，覃楚玲

（1桂林医学院，广西桂林541100；2桂林理工大学，广西桂林541004）

急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是中国十大高发恶性肿瘤之一[1]。目前，临床上治疗ALL的手段主要以应用糖皮质激素，如地塞米松等作为基础化疗药物从而减少ALL细胞的数量为主[2]，但现有治疗方案易引发水盐代谢紊乱、高血压、骨质疏松等不良反应，且会引起耐药，从而使预后变差[3]。因此，开发可替代现有治疗方案的新型抗ALL化疗药物，将在ALL的治疗中发挥重要作用。

穿心莲内酯（andrographolide，AND）是爵床科穿心莲属植物穿心莲（Andrographis paniculata）的主要活性成分，具抗炎、保肝、抗病毒等作用[4-6]，还对多种肿瘤发挥抗增殖、抗凋亡等作用[7]。当前关于AND对ALL的作用的研究非常有限，且AND对耐药性ALL的作用仍未有报道。本研究以地塞米松耐药的人源ALL细胞株CEM-C1为实验对象，观察AND对CEM-C1细胞生长的抑制作用，探讨AND对凋亡相关因子 cleaved caspase-3、cleaved caspase-7、Bcl-2和Bax的影响以及对线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）的作用，并观察AND对CEMC1细胞构建的BALB/c-nu雌性裸鼠异位移植瘤模型的影响，最后应用免疫组化法检测裸鼠肿瘤组织凋亡蛋白cleaved caspase-3的改变，以期为ALL的临床治疗提供了新策略。

材料和方法

1 主要材料

1.1 细胞株及动物 人源急性淋巴细胞白血病细胞株CEM-C1购于中科院上海细胞库。5周龄Balb/c-nu雌性裸鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SYXK（湘）2016-0002，在桂林医学院科学实验中心SPF级屏障系统中饲养。

1.2 主要试剂及仪器 AND（Sigma-Aldrich）；RPMI-1640培养基（Gibco）；青/链霉素（HyClone）；胎牛血清（Lonsera）；CCK-8试剂盒和Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（DOJINDO）；Corning®Matrigel®Basement Membrane Matrix（BD）；Wright-Giemsa染色试剂盒（Solarbio）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L）和细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（碧云天）；抗 caspase-3、cleaved caspase-3、caspase-7和cleaved caspase-7抗体（Cell Signaling Technology）；JC-1线粒体膜电位试剂盒（Thermo Fisher）。FACSAria™ Ⅲ流式细胞仪（BD）；酶标仪（Bio-Rad）；正置显微镜和荧光倒置显微镜（Olympus）；CO2培养箱（SANYO）；凝胶成像系统（Tanon）；Centro LB 960微孔板发光检测仪（Berthold）。

2 方法

2.1 细胞培养及药物配制 CEM-C1细胞培养于完全培养基，即含有1%青/链霉素和10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37℃、5%CO2培养箱中培养。AND用DMSO配成40 mmol/L的贮存液，无菌处理后分装保存于-20℃中，临用前用培养基稀释至相应的浓度。

2.2 CCK-8法检测细胞活力 取生长对数期的CEM-C1细胞，用完全培养基配成单细胞悬液，以每孔1×104个的密度接种于96孔板中，每孔接种100 μL，每个实验组设置3个复孔。24 h后，加入相应浓度的AND，正常对照（control）组加入无药物的完全培养基，溶剂对照（vehicle）组加入与AND最高剂量相应浓度的DMSO。药物作用12、24和48 h后，使用CCK-8法于酶标仪450 nm处检测细胞吸光度（A）值。细胞相对活力（%）=加药组平均A值/对照组平均A值×100%。

2.3 Wright-Giemsa染色观察细胞形态 取对数期的CEM-C1细胞，给药处理24 h后，将细胞悬液转移到离心管中，1 000 r/min离心3 min，去除上清液。加入PBS，1 000 r/min离心3 min，去除上清液。再加适量的PBS重悬细胞，取30 μL细胞悬液均匀涂布于载玻片上自然晾干，用4%多聚甲醛室温下固定30 min。按照Wright-Giemsa染色试剂盒说明书进行染色，于显微镜下采集图像。

2.4 流式细胞术检测细胞周期分布 AND处理CEM-C1细胞24 h后，收集细胞至离心管1 000 r/min离心3 min，弃上清并用预冷PBS洗涤，再次离心沉淀细胞，用在70%乙醇在4℃中固定过夜。次日，用1 000 r/min离心3 min，沉淀细胞。用PBS洗涤后，将细胞与碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液在37℃避光孵育30 min。使用流式细胞术检测细胞周期的变化情况，并分析检测结果。

2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 AND处理CEM-C1细胞24 h后，按Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit所述步骤进行annexin V-FITC及PI染色，然后上流式细胞仪检测[激发波长488 nm，发射波长530 nm；annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测，PI的红色荧光通过PI通道（FL2或FL3）检测]。

2.6 Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达 AND处理CEM-C1细胞24 h后，收集细胞至离心管，1 000 r/min离心3 min沉淀收集细胞，弃上清并用预冷PBS洗涤，再次离心沉淀细胞，将细胞用RIPA裂解液裂解后，用BCA试剂盒检测蛋白浓度，加5×上样缓冲液混匀，煮沸5 min。进行SDS-PAGE，转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂奶粉封闭2 h，将膜在4℃与I抗温育过夜。次日，将膜用1×TBST洗涤3次，之后用辣根过氧化物酶标记的II抗，在室温下孵育2 h，用1×TBST漂洗3次。避光处，将ECL显色液滴加到PVDF膜上，反应1～3 min。凝胶成像系统采集图像，应用ImageJ软件对条带进行灰度分析。

2.7 JC-1法检测细胞MMP 将CEM-C1细胞接种于6孔板中并用AND处理24 h。以羰基氰化氯苯腙（carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP；10 μmol/L）作为阳性对照，按照JC-1检测试剂盒说明书所述步骤进行染色。对染色的CEM-C1细胞进行细胞涂片、封片，并应用荧光显微镜采集图像。将细胞接种于96孔黑色底透微孔板中，按上述分组应用药物处理24 h后，每孔加入JC-1，使其终浓度为5 μmol/L。37℃避光孵育20 min后，参照文献[8]的方法，在激发波长488 nm、发射波长600 nm处检测红光荧光强度A1，在激发波长488 nm、发射波长530 nm处检测绿光荧光强度A2。各组的荧光值A=A1/A2，最终以相对荧光比例对MMP数据进行定量分析：相对荧光比例（%）=相应组别A/control组A×100%。每组实验重复3次。

2.8 AND对Balb/c-nu荷瘤鼠肿瘤生长的影响 将CEM-C1细胞重悬于无血清RPMI-1640培养基中，细胞密度控制在1×1011/L。将细胞悬液与人工合成基质胶按1∶1的体积比例混匀，然后皮下注射到5周龄雌性BALB/c-nu裸鼠右胁腹侧，每只接种200 μL。从接种当天开始，每天应用数显游标卡尺测量并按以下公式计算肿瘤体积（V）：V=L×W2×0.5，L为长度，W为宽度。将动物随机分为4组，每组4只。以注射细胞当天的天数记为0，第7天起每天分别腹腔注射生理盐水（空白组）或不同剂量的AND（0.5、1或2 mg/kg），注射容积为10 mL/kg。AND用生理盐水配制。在初次腹腔注射给药后2周（第21天）处死动物，完整剥离肿瘤组织并应用分析天平测量其重量。

2.9 免疫组化法检测荷瘤鼠肿瘤组织中cleaved caspase-3的水平 将上述所得荷瘤鼠肿瘤组织于4%多聚甲醛中固定24 h后进行石蜡包埋、切片；参照文献[9]，对切片进行热固定、去石蜡、重新水化、高温高压修复处理后，于3%H2O2室温孵育15 min以消除内源性过氧化物酶，再用PBS漂洗3次；兔抗人cleaved caspase-3Ⅰ抗（1∶500）4℃孵育过夜，PBS冲洗3次，加入Ⅱ抗孵育20 min，再用PBS充分淋洗，最后DAB显色、苏木精复染、脱水透明、树胶封片，于正置显微镜下观察并拍照。

3 统计学处理

应用SPSS 17.0软件对数据进行方差齐性检验和方差分析。实验数据以均数±标准差（mean±SD）表示，组间差异用单因素方差分析，两两间比较采用SNK-q检验。以P＜0.05时为差异有统计学意义。

结 果

1 AND对CEM-C1细胞的生长抑制作用

CCK-8结果所示，AND对CEM-C1细胞活力的抑制作用呈时间及剂量依赖性，见图1A。Wright-Giemsa染色结果显示，应用AND后，CEM-C1细胞缩小、凝聚，细胞染色加深，细胞质均质红染并且细胞数减少，进一步证明AND对CEM-C1细胞具有生长抑制作用，见图1B。

2 AND对CEM-C1细胞的周期阻滞及凋亡诱导作用

AND处理细胞24 h后，流式细胞术检测结果证明，随着药物浓度的增加，处于第2、4象限的细胞数增多，即凋亡细胞数量增多；对3次实验结果进行定量分析，结果显示，8 μmol/L AND处理24 h后，CEMC1细胞的凋亡率与空白对照组相比显著升高（P＜0.05），见图2A。AND处理24 h后，随着药物AND浓度增大，停留在G2期的细胞增加，证明细胞周期被阻滞在G2期，细胞的生长被抑制，见图2B。

3 AND对凋亡相关蛋白的影响

Western blot结果显示，AND作用 24 h，随着AND浓度的增加，活化的凋亡蛋白cleaved caspase-3/-7蛋白的量增加，当AND为10 μmol/L时，cleaved caspase-3/-7显著增加（P＜0.05）；且与空白对照组相比，随着AND的浓度增加，促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的比值增大（P＜0.01），见图3。

4 AND对CEM-C1细胞MMP的影响

JC-1在空白对照组的线粒体中正常聚集并呈现红色荧光，提示MMP正常；应用阳性对照药CCCP作用于CEM-C1细胞24 h后，细胞MMP明显降低，呈现绿色荧光；AND作用于CEM-C1细胞24 h后，随着AND的浓度增大，CEM-C1细胞的绿色荧光强度增加，指示较低的MMP，荧光定量结果进一步证明，AND剂量依赖性地降低CEM-C1细胞的MMP，见图4。因此，AND可能通过降低MMP而引起CEM-C1细胞凋亡。

5 AND对ALL裸鼠移植瘤的体积、重量及cleaved caspase-3蛋白水平的影响

观察期结束后处死动物，取瘤称重，结果发现AND各给药组的瘤体重量明显轻于control组，体积亦明显小于control组（P＜0.05或P＜0.01），见图5。这表明AND对CEM-C1细胞裸鼠移植瘤具有明显的生长抑制作用。

免疫组化结果显示，AND各给药组移植瘤组织中的棕染比例明显高于control组，染色亦明显深于control组，即AND组肿瘤细胞的cleaved caspase-3蛋白水平高于control组，且随着AND剂量的增加，棕色信号增强，说明AND在体内对ALL的凋亡诱导效应呈剂量依赖性，见图6。

讨 论

ALL的治疗手段，目前仍以地塞米松为基础药物对患者进行化疗为主，然而长期应用地塞米松引发的不良反应及耐药问题，严重降低了患者的生存质量[3]。作为广西特色中草药之一的穿心莲，其主要成分AND已被证明有较强的抗炎和抗病毒作用[10]，并对多种类型的肿瘤具有生长抑制效应[7]。有研究表明，AND可抑制ALL细胞株Jurkat的生长[11]，为AND对ALL的治疗作用提供了一定的线索。然而，当前关于AND对ALL作用的研究较为有限，且AND对耐药性ALL的作用仍未有报道。因此，我们选用对地塞米松耐药的ALL细胞株CEMC1，研究AND是否对其生长及凋亡存在调控作用。

Hanahan等[12]曾经综述过恶性肿瘤的6大生物学特征，其中第一大特征就是肿瘤细胞的无限生长。我们应用CCK-8和Wright-Giemsa染色法证实，浓度低至2.5 μmol/L时，AND作用24 h即可对CEM-C1细胞产生明显的生长抑制作用，形态上表现为细胞缩小、凝聚，细胞染色加深，细胞质均质红染。流式细胞周期检测结果进一步证明，AND能将CEM-C1细胞周期阻滞在G2期从而抑制细胞生长。因此，AND对耐地塞米松ALL细胞具有生长抑制作用，具备作为ALL患者对地塞米松耐药后候选药物的潜质。

Figure 2.AND induced apoptosis and cell cycle arrest of CEM-C1 cells.A：flow cytometry was utilized to detect the apoptosis of CEM-C1 cells treated with AND for 24 h；B：flow cytometry was utilized to detect cell cycle distribution of CEM-C1 cells treated with AND for 24 h.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图2 AND诱导CEM-C1细胞凋亡及周期阻滞

细胞凋亡属于生理性程序性细胞自杀，是由进化保守和遗传决定的，即细胞在一定的生理及病理条件下，遵循自身的程序，以细胞内caspases激活为起点自我结束生命，最后裂解为若干凋亡小体，被其他细胞吞噬，通常不伴有死亡细胞内容物释放而无炎症[13]。细胞凋亡在细胞生长过程中发挥着重要的作用。我们采用annexin V-FITC/PI双染和流式细胞术检测AND用药后的细胞凋亡情况。结果显示，不同浓度梯度的AND处理CEM-C1细胞24 h后，8 μmol/L AND对CEM-C1细胞即可发挥凋亡诱导效应，随着药物浓度增加，CEM-C1细胞凋亡率逐渐增大。

Figure 3.The effects of AND on the expression of apoptosis-related proteins in CEM-C1 cells.A：the effects of AND on the protein levels of caspase-3 and cleaved caspase-3；B：the effects of AND on the protein levels of caspase-7 and cleaved caspase-7；C：the effects of AND on the protein levels of Bax and Bcl-2.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图3 AND对CEM-C1细胞凋亡相关蛋白水平的影响

Figure 4.AND induced reduction of mitochondrial membrane potential in CEM-C1 cells（JC-1 staining，×400）.The fluorescence values of JC-1 obtained from fluorescence microplate reader were calculated as red/green fluorescence ratio and normalized as percentage of control group from 3 independent experiments.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group.图4 AND降低CEM-C1细胞的线粒体膜电位

Figure 5.The in vivo growth-inhibitory effect of AND on the ALL cell xenograft tumors.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图5 AND对ALL细胞移植瘤模型的体内生长抑制作用

Figure 6.The effect of AND on the protein level of cleaved caspase-3 in ALL cell xenograft tumors（×400）.图6 AND对ALL细胞移植瘤组织cleaved caspase-3蛋白水平的影响

为验证AND诱导CEM-C1细胞凋亡的效应，我们应用Western blot法检测应用AND后CEM-C1细胞凋亡相关蛋白的情况。作为caspase家族的关键因子，caspase-3和caspase-7是凋亡被诱导的过程中最主要的效应凋亡蛋白酶，其活化可诱导细胞发生凋亡[14]；cleaved caspase-3和cleaved caspase-7分别是caspase-3和caspase-7活化过程中经剪切产生的活性片段，其活化程度及其与caspase-3和caspase-7的比值越高，细胞凋亡越明显[15-16]。在本研究中，AND剂量依赖性地升高 caspase-3、caspase-7、cleaved caspase-3、cleaved caspase-7、cleaved caspase-3/caspase-3和cleaved caspase-7/caspase-7的水平。在此基础上，我们进一步观察AND对凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的调控作用。Bcl-2蛋白通过抑制促细胞凋亡家族成员Bax的激活来阻止细胞凋亡[17]。而作为预测抗肿瘤药物临床疗效的指标之一，Bax/Bcl-2的比值与肿瘤缓解率成正比[18]。本研究表明，AND下调CEMC1细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调促凋亡蛋白Bax的表达，提高Bax/Bcl-2的比值，从而抑制ALL细胞生长。

在细胞凋亡信号转导途径中，线粒体是发挥关键调节作用的细胞器。线粒体内膜两侧的电化学梯度的存在（即MMP）是维持线粒体生物能量合成等正常功能所必需的，MMP的下降是细胞凋亡的特异性标志[19-20]。我们应用MMP指示剂JC-1对药物处理后的CEM-C1细胞进行染色，荧光显微镜下观察MMP的变化情况。JC-1是一种能透过细胞膜的荧光染料。正常细胞的MMP较高，JC-1能依赖线粒体跨膜电势进入线粒体基质，并形成聚合物从而产生红色荧光；而当细胞发生凋亡时，MMP较低，JC-1不能聚集在线粒体基质中，此时JC-1为单体，产生绿色荧光。我们发现应用低至2.5 μmol/L的AND即可降低CEM-C1细胞的MMP，浓度为10 μmol/L时，对MMP的影响已几乎接近CCCP，提示AND能通过降低MMP从而诱导CEM-C1细胞的凋亡。而在体内实验中，应用AND后，裸鼠肿瘤生长减慢，瘤体重量和体积明显减小。鉴于caspase-3是细胞凋亡相关蛋白级联反应的终结者，且caspase-3活化成cleaved caspase-3也就意味着细胞凋亡进入了无法逆转的阶段[21]，因此我们将cleaved caspase-3作为检测凋亡的代表性指标，用免疫组化方法检测其在肿瘤组织的含量，发现AND明显提高荷瘤鼠肿瘤组织中cleaved caspase-3的水平，提示AND在体内对ALL亦有凋亡诱导作用。

综上所述，AND可诱导耐地塞米松的CEM-C1细胞发生凋亡，从而抑制其生长，说明AND有望成为新型的天然、安全的ALL治疗药物。尽管对诱导凋亡从而抑制生长的具体机制仍需进一步深入探索，然而本研究为耐药性ALL的治疗提供了初步的理论依据及新策略，并为民族医药在肿瘤药物治疗学的应用提供了新思路。