气相色谱法检测泊洛沙姆188中环氧化物杂质

段梦茹，何东升，孙会敏，熊晔蓉*，涂家生*

(1.中国药科大学药学院，药用辅料及仿创药物研发评价中心，江苏 南京 210009；2.中国食品药品检定研究院，国家药品监督管理局药用辅料质量研究与评价重点实验室，北京 100050)

泊洛沙姆为环氧乙烷及环氧丙烷的嵌段共聚物，于20世纪50年代被美国巴斯夫公司以商品名普朗尼克推出后，被广泛应用于药学领域。泊洛沙姆中心由聚氧丙烯(POP)分子组成，两侧是聚氧乙烯(POE)的两个亲水链，化学结构式为H(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aOH[1]。根据生产过程中环氧乙烷和环氧丙烷相对量的不同，泊洛沙姆分为若干个型号，各个型号间物理性质和表面活性千差万别，泊洛沙姆188共聚物为其中应用最为广泛的一种，其氧乙烯单元(a)为75～85，氧丙烯单元(b)为25～30，氧乙烯(EO)含量79.9%～83.7%，平均分子量为7 680～9 510[2]。泊洛沙姆188作为聚氧乙烯化非离子表面活性剂在药物制剂领域应用广泛，可用作药物制剂的基质、增溶剂、稳定剂、乳化剂、吸收促进剂、固体分散体载体等，以实现控制药物释放，提高药物的稳定性，增加难溶性药物的溶解度，提高药物的生物利用度等目的。其由于特殊的亲水性被广泛用于眼部给药制剂中[3]，还可应用于抗血栓研究[4-5]、血液流变学研究[6]、药物长循环、保持细胞膜完整性[7-8]、吞噬细胞活化和中性粒细胞脱颗粒等方面[9]。

环氧乙烷、环氧丙烷是泊洛沙姆生产工艺中主要原料，其对黏膜和皮肤具有刺激性，可损伤眼角膜，引起呼吸系统灼伤和肿胀，甚至组织坏死，并且具有致突性和致癌性[10]。环氧乙烷在一定条件下不稳定可转化为有害物质1,4-二氧六环。该3种化合物被国际癌症研究机构(IARC)定义为人体致癌物质，其中环氧乙烷为人体确定致癌物(1类)，环氧丙烷和1,4-二氧六环为可能的人体致癌物(2B类)。因此泊洛沙姆中环氧乙烷、环氧丙烷和1,4-二氧六环的检测对于保证药品安全性有效性都具有重要意义。

目前，《中国药典》《美国药典》及《欧洲药典》均规定了泊洛沙姆中环氧乙烷、环氧丙烷和1,4-二氧六环的检查，但《中国药典》2015年版中所规定方法在实际应用中可行性较低，规定限度的对照品浓度无法达到定量限，且规定溶剂二甲基甲酰胺严重干扰环氧乙烷及环氧丙烷的检测，无法对该三种物质实现准确检测。故本文针对这一问题，优化了泊洛沙姆中环氧乙烷、环氧丙烷和1,4-二氧六环检查方法，选择几乎无干扰且普适易得的超纯水作为溶剂，调整升温程序使各个色谱峰间分离度达到系统适用性要求，使得三种杂质在限度浓度时能够稳定达到定量限，实现环氧乙烷、环氧丙烷和1,4-二氧六环准确检测，为泊洛沙姆的质量控制提供参考。

1 材料与试药

1.1 仪器 Trace 1300、Trace 1310气相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；DB-624气相色谱柱(安捷伦公司)；Omni-A 超纯水系统(锐思捷公司)；KQ-500E 超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BSA124S型、SECURA24-1CN型电子分析天平(Sartorius公司)。

1.2 试药 泊洛沙姆188样品由3个厂家提供(南京威尔药业股份有限公司，批号：20161201、20170202、20170901；巴斯夫，批号：GNA19821B、GNA19921B；湖北葛店人福药业有限责任公司，批号：X171101、X171102、X171103)，按顺序编号，记为A1～3，B1～2，C1～3号样品。环氧乙烷标准品 (Supelco，批号：48838)；环氧丙烷标准品(Dr.Ehrenstorfer GmbH ，批号：G152933)；二氧六环标准品(中国食品药品检定研究院，批号：101136-201101)。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品储备液 环氧乙烷对照品储备液：精密移取0.4 mL环氧乙烷-甲醇溶液(50 mg·mL-1)至已预先加入约50 mL预冷超纯水的100 mL容量瓶中，轻轻摇动，盖好瓶塞，将容量瓶放置室温后用超纯水稀释至刻度，摇匀，作为浓度为200 μg·mL-1的环氧乙烷标准储备液。

环氧丙烷对照品储备液：取100 mL容量瓶，加入约50 mL预冷的超纯水，盖好瓶塞，精密称重，记录其重量。用注射器抽取约100 mg(约0.13 mL)的环氧丙烷，立刻注入容量瓶中，轻轻摇动，盖好瓶塞，再次精密称重，前后两次重量之差即为溶液中所含环氧丙烷的重量。用超纯水稀释至刻度，摇匀，作为浓度为1 mg·mL-1的环氧丙烷标准储备液。

1,4-二氧六环对照品储备液：取100 mL容量瓶，用量筒加入约50 mL超纯水，盖好瓶塞，精密称重，记录其重量。用注射器抽取约100 mg(约100 μg)的1,4-二氧六环，立刻注入容量瓶中，轻轻摇动，盖好瓶塞，再次精密称重，前后两次重量之差即为溶液中所含1,4-二氧六环的重量。用超纯水稀释至刻度，摇匀，作为浓度为1 mg·mL-1的1,4-二氧六环标准储备液。

混合对照品储备溶液：分别精密移取环氧乙烷储备液(200 μg·mL-1)，环氧丙烷储备液(1 mg·mL-1)，1,4-二氧六环储备液(1 mg·mL-1)各1 mL于同一100 mL容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇匀，制成浓度为环氧乙烷2 μg·mL-1，环氧丙烷10 μg·mL-1，1,4-二氧六环10 μg·mL-1的对照品储备液。

2.1.2 对照品溶液 对照品溶液：精密移取对照品储备液0.5 mL，置顶空瓶中，精密加超纯水4.5 mL，摇匀，密封，即得。

2.1.3 供试品溶液 供试品溶液：取泊洛沙姆188约l g，精密称定，置顶空瓶中，精密加超纯水5 mL，摇匀，密封，作为供试品溶液。

2.2 色谱条件 色谱条件(1)：参考《中国药典》2015年版(四部) “泊洛沙姆188”品种下环氧乙烷、环氧丙烷和1,4-二氧六环检查项。取本品1 g，精密称定，置顶空瓶中，精密加二甲基甲酰胺5 mL，摇匀，密封，作为供试品溶液。另取环氧乙烷、环氧丙烷和1,4-二氧六环适量，用二甲基甲酰胺稀释制成每1 mL中含0.2、1和1 μg的溶液，精密量取上述溶液5 mL，置顶空瓶中，密封，作为对照溶液。照气相色谱法(通则0521)测定，用6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱(30 m×0.25 mm×1.4 μm)(安捷伦DB-624气相色谱柱)，柱温：起始温度70 ℃，以每分钟35 ℃的速率升至220 ℃，保持5 min；氢火焰离子化检测器，检测器温度为280 ℃；进样口温度为250 ℃。顶空瓶平衡温度为80 ℃，平衡时间30 min。采用该色谱条件，环氧乙烷、环氧丙烷及1,4-二氧六环无法实现有效分离。

色谱条件(2)：以超纯水为溶剂，照气相色谱法(《中国药典》通则0521)，用6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱(30 m×0.25 mm×1.4 μm)(安捷伦DB-624气相色谱柱)，柱温：起始温度35 ℃，保持5 min，以每分钟5 ℃的速率升至120 ℃，保持5 min，再以每分钟35 ℃的速率升至220 ℃，保持5 min；氢火焰离子化检测器，检测器温度为280 ℃；进样口温度为250 ℃。顶空瓶平衡温度为80 ℃，平衡时间30 min，分流进样。各组分与前后杂质分离度均大于 1.5，理论塔板数大于等于5 000，对该方法进行方法学考察如下。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性试验 精密取超纯水5 mL置顶空瓶中，摇匀，密封，作为空白溶剂。

取空白溶剂、供试品溶液、对照品溶液照“2.2”项下色谱条件(2)进样，记录色谱图，空白溶剂对环氧乙烷，环氧丙烷，1,4-二氧六环含量检测均无干扰。

2.3.2 检测限与定量限 将对照品标准溶液溶液逐级稀释至信噪比为S/N=10时的浓度，即为各杂质的定量限；信噪比为S/N=3时的浓度，即为各杂质的检测限。照本文所优化试验条件进行试验，环氧乙烷、环氧丙烷和1,4-二氧六环对照品浓度分别为0.080 2、0.400 4和0.399 2 μg·mL-1时照“2.2”项下色谱条件(2)进样，3种物质信噪比均达到3，达到检测限；环氧乙烷，环氧丙烷，1,4-二氧六环对照品浓度分别为0.160 4、0.800 8、0.798 4 μg·mL-1时照“2.2”项下色谱条件(2)进样，3种物质信噪比均达到10，达到定量限。

2.3.3 线性试验 分别精密移取对照品储备溶液0.4、0.45、0.5、0.6、0.7 mL置顶空瓶中，精密加超纯水补足体积至5 mL，摇匀，密封，作为1～5线性测试溶液。照“2.2”项下色谱条件(2)进样，各取样点重复测定3次，记录色谱图，根据峰面积进行计算，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。线性范围、回归方程和相关系数结果见表1。所拟合线性曲线r≥0.999。各取样点峰面积RSD应不大于8.0%。

表1 环氧乙烷，环氧丙烷，1,4-二氧六环的线性范围、回归方程及相关系数(n=5)

2.3.4 精密度 取对照品溶液照“2.2”项下色谱条件(2)重复进样8次，环氧乙烷、环氧丙烷、1,4-二氧六环峰面积RSD值分别为4.1%、4.2%、4.7%，均不大于8%，结果表明该方法精密度良好。

2.3.5 加样回收率试验 随机取约1 g一批样品，经外标法检测本底值，共9份分为3组，每组加入一定浓度的对照品溶液进行加样回收率测定。回收率试验按照《中国药典》规定限度的80%、100%和120%分别添加低、中、高浓度对照品溶液，即分别向样品中精密加入0.4、0.5和0.6 mL对照品储备液，并加入超纯水补足体积至5.0 mL。照“2.2”项下色谱条件(2)进行测定，记录色谱图，根据峰面积进行计算。环氧乙烷80%、100%和120%限度浓度水平下的平均回收率(n=3)分别为87.12%、86.11%和85.31%，其RSD分别为1.5%、3.0%和4.2%；环氧丙烷80%、100%和120%限度浓度水平下的平均回收率(n=3)分别为82.49%、77.76%和95.94%，其RSD分别为1.2%、2.8%和3.5%；1,4-二氧六环80%、100%和120%限度浓度水平下的平均回收率(n=3)分别为83.20%、81.01%和108.9%，其RSD分别为3.4%、4.6%和2.0%；各浓度回收率溶液回收率均在75%～120%之间，RSD均不大于8.0%，符合要求。

2.4 样品含量测定 分别取 9 批不同批次的泊洛沙姆188约1 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，以外标法计算含量，9批样品中环氧乙烷，环氧丙烷及1,4-二氧六环均未检出。

3 讨论

3.1 升温程序的优化 环氧乙烷和环氧丙烷沸点较低，照《中国药典》2015年版(四部)泊洛沙姆188环氧乙烷，环氧丙烷，1,4-二氧六环检查项方法：“起始温度70 ℃，以每分钟35 ℃的速率升至220 ℃，保持5 min”进样，初始温度过高，升温速率过快，环氧乙烷、环氧丙烷和1,4-二氧六环无法有效分离，无法确定目标峰位置(见图1A)。本文将起始温度降至35℃，并保持5 min，降低升温速率至5 ℃·min-1，程序升温条件优化为“起始温度35 ℃，以每分钟5 ℃的速率升至120 ℃，保持5 min，每分钟35 ℃的速率升至220 ℃，保持5 min”(见图1B)，结果表明该方法使得环氧乙烷，环氧丙烷，1,4-二氧六环间分离度均不小于2.0，但采用《中国药典》检测方法规定溶剂二甲基甲酰胺，导致环氧乙烷及环氧丙烷色谱峰位置有杂峰干扰检测，故需对溶剂进行优化。

3.2 溶剂的选择 参考《中国药典》2015年版(四部) “泊洛沙姆188”品种下环氧乙烷，环氧丙烷，1,4-二氧六环检查项，以二甲基甲酰胺作为溶剂配制对照溶液后，照色谱条件二进样，气相色谱图见图2A，结果表明采用二甲基甲酰胺为溶剂时，溶剂在保留时间2～5 min内有杂质峰，而环氧乙烷及环氧丙烷两目标物在此时间段内出峰，影响了环氧乙烷及环氧丙烷检测含量检测；采用顶空级二甲基甲酰胺后杂质峰依然影响目标物含量检测(见图2B)。故更换溶剂为二甲基亚砜及超纯水，分别以二甲基亚砜及超纯水作为溶剂配制对照溶液后，照色谱条件二进样，气相色谱图见图2C和图2D，由图中可以看出，采用二甲基亚砜为溶剂时，仍然有杂质峰存在影响环氧乙烷及环氧丙烷的检测，而采用超纯水为溶剂时，由于超纯水在氢火焰离子化检测器上无响应，对分析系统无污染，故溶剂在环氧乙烷、环氧丙烷和1,4-二氧六环出峰位置均无杂质峰出现，不影响环氧乙烷和环氧丙烷检测，且泊洛沙姆188在水中易溶，后续试验均采用超纯水为溶剂配制对照溶液及供试品溶液。

照优化后试验条件，各样品以超纯水作为溶剂，照色谱条件(2)进样，对照溶液及供试品溶液气相色谱图如图3所示，环氧乙烷、环氧丙烷及1,4-二氧六环检测均不受干扰。

3.3 环氧乙烷、环氧丙烷、1,4-二氧六环的含量分析 取9批不同批次的泊洛沙姆188，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，9批样品中环氧乙烷，环氧丙烷及1,4-二氧六环均未检出。说明不同厂家批次的泊洛沙姆188中环氧乙烷、环氧丙烷及1,4-二氧六环含量差异不大，基本无此3种有害物质残留。

4 小结

本文建立了顶空-气相色谱法同时测定泊洛沙姆中环氧乙烷、环氧丙烷和1,4-二氧六环残留量的分析方法，与《中国药典》2015年版(四部)泊洛沙姆188品种下环氧乙烷、环氧丙烷和1,4-二氧六环项下检查方法相比，本文方法优化了样品溶剂及升温程序，将样品溶剂由二甲基甲酰胺修改为超纯水，消除了溶剂峰干扰，使得检测方法更简便易行，溶剂环保易得，而升温程序的调整使得环氧乙烷及环氧丙烷以及其他低沸点杂质能够实现完全分离，色谱峰互不干扰，调整后方法可行性高、结果准确。本方法适用于泊洛沙姆中环氧乙烷、环氧丙烷和1,4-二氧六环残留量的测定，可为泊洛沙姆188的质量控制提供参考。

·综 述·