酶解制备柞蚕蛹多肽及柠檬酸改善风味研究

黄静雅 张 禹 朴美兰 魏福安 李晓艳 李喜升

(辽宁省蚕业科学研究所,辽宁凤城 118100)

多肽作为一种蛋白质形式，具有低抗原性、易吸收、抗氧化、降血压等特点[1]，其来源主要有动植物蛋白、微生物蛋白[2]。目前，制备多肽方法主要有酸水解法、碱水解法、酶水解法、合成法等[3]，其中，蛋白酶水解法因其反应条件温和、易于控制，目前利用蛋白酶水解法制备多肽的研究众多，但这些研究主要以农产品、水产品以及桑蚕蛹为主要研究对象[4-7]，而关于柞蚕蛹制备多肽的研究则鲜见报道[8-12]。此外，这些研究大都围绕酶解工艺展开，对酶解产物的后续处理的研究相对较少，改良蚕蛹酶解产物的色泽和风味主要采用活性炭、β-环糊精吸附法等[13]，这些方法操作繁琐还容易造成活性炭污染，尤其是蚕蛹酶产物的苦味、涩味等不良风味问题没有得到根本的解决。相关研究表明，酶解产物的风味等宏观评价指标直接影响着多肽下游产品的品质，在灭酶的过程中添加适量的柠檬酸可以改良的苦味和涩味、提升酶解液的总体风味且不会造成营养的损失[14]。我国柞蚕蛹年产量巨大，但关于柞蚕蛹的研究报道在数量和技术性方面却远不及桑蚕蛹。因此研究柞蚕蛹蛋白的酶解和后续工艺可完善酶法制备柞蚕蛹多肽工艺流程，控制柞蚕蛹多肽品质，从而拓展其在食品、饮料工业、以及保健品行业的应用。

本文以脱脂柞蚕蛹为原料，采用蛋白酶酶解制备柞蚕蛹多肽，考察了酶试剂种类对水解度和多肽含量的影响、单因素酶解条件对水解度的影响，结合Box-Behnken中心组合设计原理对酶解工艺参数进行响应面优化。在灭酶过程中添加适量的柠檬酸量，用透析法除盐，通过微滤后真空干燥获得柞蚕蛹粉，并对其进行了感官评价，现将相关结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料试剂与仪器设备

脱脂柞蚕蛹粉(实验室自制)，中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶(丹麦诺维信公司)，其他常用试剂均为分析纯，透析袋截留分子量500 D。ST -16R ThermoFisher高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技有限公司)，722分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，HJ-6A多头磁力加热搅拌器 (江苏科析仪器有限公司)，高速万能粉碎机 (天津市泰斯特仪器有限公司)，SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 柞蚕蛹脱脂蛋白粉制备

新鲜柞蚕蛹经漂洗水煮后除去内脏和蛹皮，热风干燥后粉碎，在50 ℃条件下用石油醚经索氏抽提器中提取6 h脱除脂肪，干燥箱中挥发溶剂，磨细过80目筛，制得柞蚕蛹脱脂蛋白粉密封后于-18 ℃条件下储存备用。

1.2.2 柞蚕蛹多肽制备

取适量预处理后蚕蛹蛋白粉于锥形瓶中，添加双蒸水使液料比为20∶1，将锥形瓶置于磁力加热搅拌器搅拌加热，待温度恒定至50 ℃，调节pH至酶解最适pH值后添加2%的蛋白酶(以脱脂蛋白粉计)，恒温酶解6 h，反应过程中用0.5 mol/L的盐酸和氢氧化钠调节使pH保持在最适值范围，酶解完成后90 ℃以上水浴灭酶20 min，5 000 r/min离心10 min，取上清液定容至120 mL，制得的蚕蛹蛋白多肽液于4 ℃储存备用。

1.2.3 酶解试验

1.2.3.1 酶试剂的确定

分别用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶酶解预处理后的柞蚕蛹蛋白，固定酶解条件为50 ℃、6 h、pH7.0(碱性蛋白酶pH8.5)，测定水解度和多肽含量，每组实验重复3次，取3次实验的平均值。

1.2.3.2 酶解单因素试验

为了考察各因素对酶解液水解度的影响，选择两种较为适宜的酶试剂进行柞蚕蛹多肽制备试验，在探讨的影响因素基础上，保持其他的参数不变即液料比15∶1、酶添加量2%(以脱脂柞蚕蛹粉计)、酶解温度50 ℃、反应时间6 h、pH7.0进行实验，测定水解度。因素与水平如表1，所有实验进行3次重复，取结果的平均值。

表1 酶解工艺试验因素与水平

1.2.3.3 响应面实验设计

为进一步研究各变量之间交互作用的影响关系，使用响应面分析法筛选最佳酶解工艺。每个单因素的初步研究是响应面优化的指导范围，运用根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，在固定pH7.0，酶添加量2%(中性蛋白酶∶复合蛋白酶=1∶1)的条件下，选择对水解度有显著影响的三个因素：液料比A、反应时间B、反应温度C进行三因素三水平的响应面分析试验。响应面试验因素水平见表2。

表2 响应面试验因素水平和编码

1.2.4 柠檬酸对酶解液品质的影响

在液料比15∶1，50 ℃，pH7.0条件下添加2%的中性蛋白酶酶解4 h，酶解完成后向酶解液中添加适量柠檬酸煮沸30 min灭酶，4 000 r/min离心10 min取上清液4 ℃保存待测。研究柠檬酸添加量分别为0%、0.5%、1%、2%(以酶解液质量计)时上清液中氨基酸态氮的含量，以及对酶解液鲜味、苦味、涩味和酸味的影响[9]。

1.2.5 酶解液的精制

1.2.5.1 脱盐

酶解液在4 ℃条件下透析48 h，透析过程中适时更换溶液。

1.2.5.2 浓缩干燥

微滤器微滤除去酶解液中的大分子蛋白，获得的澄清透明的蚕蛹多肽液，旋转蒸发浓缩后于真空干燥箱中烘干得柞蚕蛹多肽粉[14]。

1.2.5.3 蚕蛹多肽品质

采用模糊感官评价法对所得柞蚕蛹多肽粉颜色、滋味与气味、杂质几个方面进行感官评价；由5男5女共10人组成评价小组，按表3进行综合感官评价。

表3 感官评价评分指标

1.2.6 指标测定方法

1.2.6.1 水解度的测定

水解度/%=(酶解液中氨基态氮含量/样品中总氮量)×100

氨基态含量测定：甲醛电位滴定法[15]

样品中总氮量测定：凯氏定氮法[16]

1.2.6.2 多肽含量的测定

以标准结晶牛血清清蛋白为标准蛋白溶液绘制标准曲线； 取2 mL酶解液加入2 mL 15%的三氯乙酸混匀后静置沉淀10 min，5 000 r/min离心10 min，取上清用双缩脲法[17]测定吸光值，代入标准曲线测定多肽含量。

2 结果与分析

2.1 酶试剂种类对水解度和多肽含量的影响

由图1可知中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和复合蛋白酶的酶解产物拥有较高的水解度，水解度的高低与蛋白酶酶切位点有关。胰蛋白酶的特异性强，主要裂解赖氨酸和精氨酸的羧基端化学键，造成酶解物水解度较其他蛋白酶低[18]；而中性蛋白酶和复合蛋白酶酶解作用下的产物多肽含量较高，因此本研究选用中性蛋白酶和复合蛋白酶进行酶解条件试验，考察其在不同的液料比、酶添加量、反应温度和反应时间条件下酶解液的水解程度。

2.2 两种蛋白酶单因素酶解条件结果

不同酶解条件下中性蛋白酶、复合蛋白酶酶解产物的水解度见图2。

图2A所示，两种蛋白酶在6 h反应时间内，随着液料比的减小，酶解产物的水解度呈增大趋势，由于底物浓度越大，单位时间内可供酶作用的位点越多，酶的催化越能够充分发挥作用。但当液料比小于15∶1时，复合蛋白酶水解度缓慢下降，液料比小于10∶1时，中性蛋白酶水解度呈下降趋势，这可能是由于底物浓度过高影响了蛋白质结构的充分伸展，进而降低了酶解速率，底物浓度过大会造成生产成本的提高，因此在后续实验中选择液料比15∶1进行单因素酶解实验。

图2B所示，两种酶的添加量越大，酶解产物的水解度越大，由于料液比值固定，酶添加量越多，酶与底物上的酶切位点作用接触的几率增加反应速率加快；中性蛋白酶和复合蛋白酶分别在添加量大于2%和3%时，水解度的增大趋势变缓。这可能是因为反应底物上可供酶切位点并没有随着酶添加量的增大而增加，但大量的酶催化底物发生反应所得产物浓度升高却导致了水分活度的下降，使反应速率下降[15]。考虑成本因素，中性蛋白酶的酶添加量2%较为适宜，复合蛋白酶的添加量应控制在3%以下。

由图2C可知，随着反应温度的提高，酶解产物的水解度呈现先上升后下降的趋势，反应温度为50 ℃时两种酶水解度最高。温度上升，反应体系中水分活度提高使反应加剧，同时酶活性增大，二者协同提高了反应速率。但因酶催化有其适宜温度范围，温度过高会使酶失活，造成反应速率下降。因此50 ℃是中性蛋白酶和复合蛋白酶适宜的反应温度。

由图2D可知，水解度与反应时间成正比。复合蛋白酶在6 h后酶解产物水解度提升速度减缓，中性蛋白酶的酶解液水解度在10 h后提升变慢。这说明随着酶解反应的进行，酶产物的大量积累对酶解产生了反馈抑制。在实际生产中，可根据目标产物要求，通过控制酶解反应时间达到适度水解或者深度水解目的。

2.3 响应面优化酶解工艺条件结果与分析

2.3.1 响应面拟合回归方程的建立

为探究柞蚕蛹多肽制备最佳工艺参数，根据单因素试验结果，采用Box-Behnken设计原理对酶解工艺条件进行优化，实验结果和各因素相互效应图见表4和图3-5。

表4 试验设计与结果

利用Design-Expert 10.0软件对实验数据进行分析，得到水解度Y、液料比A、反应时间B和反应温度C的多元二次回归方程：

Y=29.97+6.86A+1.49B-0.99C+0.34AB-1.61AC-0.45BC-0.63A2-1.67B2-1.18C2

2.3.2 响应面拟合回归方程的方差分析结果

表5 响应面拟合回归方程的方差分析结果

2.3.3 响应面模型的验证试验

为进一步确定柞蚕蛹多肽最优加工工艺，根据Design-Expert 10.0软件运行结果，水解度在液料比、反应时间和反应温度的共同影响下的最优提取工艺为：液料比19.79∶1、反应时间9.03 h、反应温度52.29 ℃，在此条件下模型预测的水解度为37.608%。为检验模型的准确度，在选择在液料比20∶1，反应时间9 h、反应温度52 ℃、pH7.0工艺下进行3次平行验证实验，所得实际水解度平均值为36.84%±0.41%，与预测值相近，响应面优化后的酶解工艺参数可应用于实际。

2.4 柠檬酸对酶解液品质的影响

表6 柠檬酸添加量对酶解液品质的影响

蛋白质水解过程中容易生成有苦味的肽分子，这些苦味肽大多数是一些疏水性氨基酸。有机酸类可以在一定的条件下对蛋白质进行水解，这种水解液不但可以改善水解液的口感，而且不存在安全类的问题[18]。由表6可知，在灭酶的同时加入柠檬酸不会降低产品的氨基酸态氮含量，还可掩盖酶解液的苦味、涩味等不理想滋味，而柠檬酸添加过多会使产物酸度过大，因此添加0.5%柠檬酸较为适宜，此方法可应用制作柞蚕蛹多肽饮品、口服液、固体饮料等。

黄美佳[19]等在桑蚕蛹酶解液灭酶后添加8%蔗糖和1%柠檬酸制得蚕蛹蛋白肽口服液。根据实验观察，在灭酶的过程中加入柠檬酸不但可以改善产物风味，可以提高酶解液的色泽明亮澄清度，而在灭酶后加入柠檬酸对色泽的改善效果则会降低；这可能是由于经过高温灭酶增强了酶解液中疏水性氨基酸等呈色物质的稳定性，减弱了柠檬酸对呈色物质的还原能力。

2.5 柞蚕蛹多肽品质

将制得的蚕蛹肽粉参照GB/T 22492-2008 大豆肽粉感官评价指标从色泽、气味、口感三个方面进行评分[20]，每个项目满分为10分。见图6。

由图6可知柞蚕蛹多肽粉色泽较好，颜色均一明亮；气味良好，无异味；口感细腻，可以在此基础上进一步开发相关食品。

3 结 论

本实验通过单因素结合响应曲面法对制备柞蚕蛹多肽的工艺条件进行优化，获得酶解最佳工艺条件为：液料比20∶1，反应时间9 h、反应温度52 ℃、pH7.0，中性蛋白酶和复合蛋白酶(双酶比=1∶1)总添加量2%，此工艺下制备的柞蚕蛹多肽水解度为36.84%±0.41%；在灭酶的过程中添加0.5%的柠檬酸可改善酶解液的苦味、涩味，原有的鲜味不会受到影响。真空干燥酶解液制备柞蚕蛹多肽粉并对其进行模糊感官评价，表明产品色泽浅黄均一、明亮，具柞蚕蛹特有的香气和鲜味、无异味，可添加至食品、饮料中作为主配料。

4 讨 论

在我国很多地区有食用柞蚕蛹的习惯，柞蚕蛹是一种常见的重要过敏源，蛹皮中含有的几丁质和蛹肉中的一些大分子蛋白可引起部分人群食入性过敏[21]，本研究通过酶切使蚕蛹中的大分子蛋白被水解成了小分子多肽，并通过微滤降低去除不溶的大分子蛋白和杂质。前人研究表明，肽混合物在人体的吸收率和吸收速度比单纯的氨基酸更佳，因此本文建立的柞蚕蛹多肽加工工艺可生产出易吸收、低敏性的柞蚕蛹多肽，可为柞蚕蛹类产品加工提供技术支撑。

柠檬酸是一种常用的食品添加剂，普遍用于汽水饮料、葡萄酒、糖果、点心、饼干、罐头果汁、乳制品等食品的制造。酶解液中加入柠檬酸可显著改进风味，掩盖了原有的苦味、涩味，这与赵谋明等[18]所报道的味精菌体酶解结果相符合；柠檬酸同时兼具调色剂功能，使酶解液由褐色变为淡黄色[14]，这对柞蚕蛹多肽产物的感官评价具有积极的影响，可应用于柞蚕蛹多肽固体饮料以及多肽口服液等产品的制造，而关于柠檬酸对酶解产物风味的和色泽的形成和机理还有待进一步的研究。