肉鸡大肠杆菌病病原分离、鉴定及药敏试验

韩金宏 葛晨晨 李太元

摘 要：本文对延吉地区某鸡场送来的10例肉鸡大肠杆菌疑似感染病例进行病原分离与鉴定、菌株致病性试验和药物敏感性试验等。就实验结果进行分析，有8株疑似菌株，呈短杆状，革兰氏染色阴性菌，形态特征及生化鉴定符合大肠杆菌特性，确定为大肠杆菌菌株，具有较强的致病性，对β-内酰胺类、四环素类、氯霉素类药物均有较强的耐药性，但对喹诺酮类药物的敏感性较强。

关键词：大肠杆菌;鉴定;肉鸡;药敏试验

大肠杆菌病是由致病性大肠埃希杆菌引起的一种较为常见的传染性疾病，可造成人和畜禽的腹泻、出血性胃肠炎，严重的可造成死亡，易对畜牧养殖业造成严重损害。

目前，临床上防控大肠杆菌传染常使用抗生素，而抗生素的滥用不仅会使耐药菌大量产生，还会使得抗生素及耐药菌株跟随食物链进入人体，对人体健康造成一定程度的威胁。同时，全世界各地区流行的大肠杆菌菌株对于抗生素的耐药性均有不同程度的差异，也给大肠杆菌的防控带来了困难。本文通过一系列试验并对结果进行分析，以期为大肠杆菌病的防控防治工作提供参考依据。

1.材料与方法

1.1肉鸡病例

延吉某鸡场送来5只疑似大肠杆菌感染致死的肉用鸡及5只未死的同笼鸡待检。鸡群出现流行病学症状后曾使用该养殖场常用的头孢类药物，但未能有效控制疾病传播。

1.2主要药品和试剂

实验所用LB肉汤、麦康凯培养基、伊红美兰培养基及琼脂粉均购自北京奥博星生物技术有限公司，革兰氏染液购自河南柯炫生物技术有限公司，生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3主要仪器

压力蒸汽灭菌器（MSL.N型），生物显微镜（BX53型），净化工作台（SW-CJ-2FD型），电热恒温培养箱（HH-B11？600-S型）。

1.4临床观察及采集样品

病死鸡剖检可见：小肠、泄殖腔等粘膜弥漫性出血，有不同程度的出血点、出血斑;胆肿大;心外膜有黄白色胶冻样纤维性渗出物附着;心包液增多、肝脏肿大、质脆、呈暗红色或土黄色;就肝脏部分进行无菌采样，进行实验室诊断。对同笼活鸡进行临床诊断，发现同笼活鸡出现精神沉郁，食欲减退的现象，且个别伴有腹泻的症状，将活鸡处死后对肝脏部分进行采样并带回实验室。

1.5细菌分离及纯化

无菌操作采集病料，在麦康凯培养基上进行划线接种，置恒温培养箱37℃下24h培养，选取红色独立菌落在麦康凯培养基上连续传代3次后，在伊红美兰培养基上接种，选取紫黑色且带有金属光泽的菌落进行纯化，并对该菌种进行保存。

1.6分离细菌的鉴定

1.6.1细菌形态及染色特性观察

对分离菌株进行革兰氏染色，显微镜下观察形态及染色特征。

1.6.2细菌生化实验检测

对分离纯化的疑似菌株进行糖发酵试验、V-P试验、MR试验、运动力试验并观察记录，选取符合大肠杆菌生化特性的菌株进行致病性试验。

1.7细菌致病性实验

将生化鉴定后的大肠杆菌接种于LB肉汤液体培养基中培养24h，稀释菌液至3×10？cfu/mL，备用;选用C57小鼠作为实验动物，3只/组，设立对照组，腹腔注射稀释菌液0.3ml/只，进行为期48h的观察，记录采食量、饮水量、精神状态、排粪情况及其它病状。及时进行剖检及肝脏血涂片，显微镜下观察细菌。

1.8细菌药敏试验

选用庆大霉素（GEN）、青霉素（P）、四环素（TET）、头孢噻肟（CTX）、氧氟沙星（OFL）、氯霉素（C）等抗菌药物进行药敏试验。

将分离出的大肠杆菌接种于普通培养基上培养18h，选取多个菌落用无菌生理盐水配制成菌悬液，调整含菌量为1.5×10？cfu/mL，吸取350微升于4mm厚基础培养基上，均匀涂抹后将预先准备好的药敏纸片贴在培养基上，24h后观察结果进行记录分析。

2.结果与分析

2.1细菌形态观察结果

细菌经革兰氏染色，镜下观察呈革兰氏阴性，菌体呈短杆状，大小为0.3-0.6×1.1-1.7μm，单独或成组分布，无芽孢（参见图1）。

2.2生化试验结果

分离细菌生化实验结果如表1所示[1]。

2.3致病性试验结果

攻毒6h后，小鼠普遍出现食欲不良，精神萎靡的症状，眼角出现白色颗粒状物质;12h开始，出现死亡病例，肛门处有粪便渍粘于毛发上;36h后，不再出现死亡病例，食欲及饮水量逐渐恢复正常;48h后处死所有小鼠，进行剖检及血涂片检测，对照组始终未出现任何症状。

对病死的实验鼠进行剖检，普遍可见腹部膨大，有腹水，呈淡黄色胶冻样液体，味恶臭，肠道有不同程度的出血点、出血灶;胃部肿大，积有脓性分泌物，个别可见坏死灶;肝部肿大，质脆，个别可见出血点、灰白色坏死灶或结节。处死的实验鼠亦可见上述病况，但相对较轻。

肝脏血涂片镜检可以观察到两端钝圆的G-短杆状菌数量不等的散在排列在抹片上（参见图2）。

根据致病性试验结果分析可知，细菌形态且剖检结果符合大肠杆菌致病病理变化。

2.4药敏试验结果

根据药物敏感性实验结果（见表2）参照多重耐药（MDR）、泛耐药（XDR）、全耐药（PDR）多重耐药菌暂行标准，计算菌株对各类药物的耐药率及敏感率（见表3）。

对药敏试验结果进行分析，大肠杆菌对青霉素、头孢克肟、四环素、氯霉素药物具有较强的耐药性，而对氧氟沙星最为敏感，庆大霉素次之。

3.结论

根据上述实验结果分析，该养殖场送检的肉鸡病例可以确定为大肠杆菌感染，所感染的大肠杆菌致毒力较强，易对该鸡场的禽类造成严重损害，对生产养殖亦造成嚴重阻碍。且养殖场频繁使用抗生素使得大肠杆菌耐药性增强，对药物的敏感率普遍较低。

4.建议

（1）轮换使用各类抗生素，避免同一类抗生素在一段时间内频繁使用，少用或不使用耐药性高的抗生素，慎用敏感性高的药物。

（2）适当增加维生素和微生态制剂，以加强动物机体抵抗力;定时添加乳酸菌片，保证动物机体的肠道菌群平衡。

（3）做好饲养管理工作，保障饲养场所的干净卫生和通风性，定期进行消毒清理工作，保证饮食质量，防止饮水和饲料受到污染。

（4）结合实际情况，选择性地对畜禽进行免疫接种。

（5）及时发现并隔离患病畜禽，对整个畜群进行药物防治，适当采用中西医结合的治疗方法。

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作者簡介：

一作：韩金宏（1998-），男，汉族，本科在读，延边大学，研究方向：动物医学

二作：葛晨晨（1998-），男，汉族，硕士在读，延边大学，研究方向：微生物学

通讯作者：李太元（1962-），男，朝鲜族，硕士学位，教授，延边大学，研究方向：微生物学与免疫学 .