前列环素E1 对肝动脉碘化油栓塞术后肝纤维化家兔的影响

李 磊, 李向利, 胡惠敏

(苏州市相城人民医院1. 肝胆外科, 2. 普外科, 3. 病理科, 苏州215131)

近年来，原发性肝癌发病率和病死率均呈上升趋势[1-2]。随着介入治疗快速发展，临床研究发现肝动脉化疗栓塞术(transarterial chemoembolization,TACE)能有效缓解患者临床症状，并延长生存期。除完全门静脉癌栓阻塞和严重肝硬化门静脉高压是禁忌外，多数患者都适用TACE 治疗；TACE 的适应证较广，创伤小，恢复快，费用低，已广泛应用于肝癌患者的治疗[3]。然而在TACE 操作过程中，化疗药物容易渗入非病灶处血管，造成肝损伤，引起肝纤维化及肝硬化的发生，严重者会导致患者急性肝衰竭[4-6]。Smad(small mothers against decapentaplegic)蛋白在将转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)信号从细胞表面受体转导至细胞核的过程中起到关键性作用，且不同的Smad 介导不同TGF-β 家族成员的信号转导。既往研究发现，肝硬化组织中Smad2和Smad4 mRNA表达水平显著升高，这可能与Smad/TGF-β1 通路在器官纤维化过程中被激活有关：在器官纤维化过程中TGF-β1 高表达作用于Smad 基因，导致Smad mRNA 高表达，从而诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，导致纤维化发生[7-8]。前列环素E1(prostacyclin E1，PGE1)是具有广泛调节功能的内生物质。近年来研究发现，PGE1 能通过调节机体抗氧化系统应激反应，减少脂质过氧化发生，从而减少受损组织纤维化的发生[9-10]。本文拟探究PGE1 对肝动脉碘化油栓塞术后肝纤维化家兔Smad2 和Smad4 mRNA水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通级成年新西兰白兔36 只，其中雄兔24只，雌兔12 只；18～22 周龄，体质量2.0～2.1 kg。实验兔购自苏州高新区镇湖实验动物科技有限公司[SCXK(苏)2013-0002]，饲养于苏州大学实验动物中心实验动物楼[SYXK(苏)2014-0029]。动物实验经苏州市相城人民医院生物医学研究福利伦理委员会批准[(2016)伦审批第(010)号]。

1.2 主要仪器和试剂

酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒购自美国R＆D 公司，具体操作按说明书进行；RT-PCR试剂盒购自杭州碧云天生物技术研究所；戊巴比妥钠购自武汉东康源科技有限公司；气管导管、微导丝及导管均购自泰州科创医用制品有限公司；数字减影血管造影(digital subtraction angiography，DSA)仪购自北京华贺技术有限公司；碘化油购自上海万代制药公司；PGE1 购自上海浩然生物技术有限公司；TRIzol 试剂和莫洛尼小鼠白血病病毒(M-MLV)反转录酶购自上海泰乐生物科技有限公司。

1.3 兔肝纤维化模型建立及干预

采用随机数字表法分组，将36 只新西兰兔分为模型组、给药组与假手术组。所有实验兔选择入组后均在苏州大学实验动物中心的动物饲养房中饲养1 周，于手术前1 d 禁食禁水。手术过程：取实验兔，从耳缘静脉完成静脉置管后，予以戊巴比妥钠30 mg/kg 缓慢推注，直至兔疼痛反射消失；将实验兔置于操作架上，经口插入气管导管，调整呼吸机参数，维持呼吸频率20～30 次/分；将实验兔固定于DSA 操作台，腹股沟区备皮、消毒、铺巾后，切开皮肤及肌肉组织以暴露股动脉，使用动脉穿刺针穿刺股动脉，并置入26F 微导丝及导管；于实验兔肝区附近行DSA，引导微导管经肝胃动脉进入肝右动脉；DSA 引导下，分别推注碘化油1 mL(模型组)、碘化油1 mL+0.2 mL PGE1(给药组)或生理盐水(即0.9%氯化钠溶液)1 mL(假手术组)；推注完成后复行DSA 造影，见推注区阴影扩散，可认为建模成功，于是退出微导丝导管，逐层缝合、消毒后完成手术。

1.4 观察指标

1.4.1 血清学相关指标测定 分别于术后2、4、6 和8 d 经兔耳缘静脉抽取静脉血2 mL，静置后取上清液，采用ELISA 试剂盒测定血清中透明质酸(hyaluronic acid，HA)、层黏连蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前胶原(procollagen type Ⅲ，PC Ⅲ)和Ⅳ型胶原(type Ⅳ collagen，Ⅳ-C)含量。

1.4.2 肝组织纤维化程度的病理评分 术后8 d处死实验兔，取其肝组织，置于40 g/L 甲醛溶液中固定标本。取1.5 cm×1.5 cm×0.5 cm 组织块，脱水后石蜡包裹，切片，行H E 染色。光学显微镜下观察肝组织纤维化程度，判断分期标准[11]如下：S0，肝组织正常，镜下未见胶原纤维；S1，镜下可见中央静脉周围汇管区有轻度胶原纤维延伸；S2，镜下可见中央静脉周围汇管区有明显的胶原纤维延伸，但未相互连接；S3，镜下可见中央静脉周围汇管区有明显的胶原纤维延伸，且已连接包裹分割肝小叶；S4，镜下可见肝小叶生成，形态以方形为主；S5，肝小叶结构不完整，形成假小叶，小叶间纤维粗大；S 6，肝内布满圆形假小叶。

1.4.3 肝组织中Smad2 和Smad4 mRNA表达水平检测 取处死后实验兔的肝组织，研磨后加入蛋白裂解液，3 000 r/min 离心10 min，取上清液，根据TRIzol 试剂说明书进行操作，采用异硫氰酸胍一步法提取组织中RNA。用1%的琼脂糖凝胶电泳确定总RNA 的完整性，用紫外分光光度计检测RNA 的含量和纯度。然后分别取3 µg 总RNA，再加入Oligo(dT)和M-MLV反转录酶后，以25 µL体系在42 ℃下反应1 h 合成第一链cDNA，之后加热至94 ℃ 3 min 以灭活反转录酶。以RNA 反转录后得到的cDNA 为模板进行PCR 扩增，以检测组织中Smad2 和Smad4 mRNA表达水平。Smad2 基因的上游引物序列为5'-ATACCCACTCCATTCCAG-3'，下游引物序列为5'-CACTATCACTTAGGCACTCG-3'；Smad4 基因的上游引物序列为5'-ACCTTTACACTCCAACTGC-3'，下游引物序列为5'-AACTTCCCCAACATTCCT-3'；β-actin 作为内参，上游引物序列为5'-ACTGCCGCATCCTCTTCCTC-3'，下游引物序列为5'-ACTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3'。PCR条件：首先，95 ℃预变性5 min；然后，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 60 s，32 个循环；最后，72 ℃保温5 min。扩增产物加入1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外灯下拍摄，用紫外分光光度分析仪进行定量分析。采用2-△△Ct法分析靶基因的相对表达水平。

1.5 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据处理及分析。计量资料以表示，多组间比较方差齐时用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验；计数资料用n(%)表示，组间比较采用χ2检验。设α ＝0.05 为检验标准，以P ＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清学指标

ELISA 检测结果(表1)显示，假手术组实验兔术后2、4、6 和8 d 时，血清HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C 水平无明显改变(P ＞0.05)；给药组和模型组各时间点的血清学指标均较假手术组明显升高，且随着时间增加，上升程度更明显(均P ＜0.05)；而且给药组各时间点的血清学指标均较模型组明显下降(均P ＜0.05)。

2.2 肝组织纤维化程度

HE 染色结果(图1)显示，假手术组实验兔在术后8 d 时肝病理学检查未发现明显纤维化。给药组和模型组兔的病理学标本均发生了不同程度的肝纤维化，其中给药组的S1～S6 期兔分别为0、1、2、3、6、6 和0 只，而模型组分别有0、0、0、5、6 和1 只。给药组较模型组的纤维化程度明显降低，组间差异有统计学意义(P ＜0.05)。

2.3 肝组织中Smad2 和Smad4 mRNA表达水平

RT-PCR 结果(图2)显示，给药组和模型组较假手术组的兔肝组织中Smad2 和Smad4 mRNA表达水平均明显升高，且给药组较模型组的兔肝组织中Smad2 和Smad4 mRNA表达水平明显下降，差异均有统计学意义(P ＜0.001，表2)。

表1 三组实验兔术后不同时间点的血清学指标Table 1 Serological indices of the three groups of experimental rabbits at different time points after operation (, n=12)

表1 三组实验兔术后不同时间点的血清学指标Table 1 Serological indices of the three groups of experimental rabbits at different time points after operation (, n=12)

注: 与同一时间点的假手术组比较, *P<0.05; 与同一时间点的模型组比较, #P<0.05。

组 别 术后时间/d HA ρ/(ng·mL-1) LN ρ/(ng·mL-1) PC Ⅲ ρ/(ng·mL-1) Ⅳ-C ρ/(ng·mL-1)假手术组模型组给药组2 4 6 8 2 4 6 8 2 4 6 8 30.15±2.45 30.68±1.84 31.84±4.25 31.68±2.47 47.95±4.81*48.16±6.15*50.22±6.64*53.21±5.17*42.89±1.76*#44.21±0.43*#45.74±0.52*#46.54±2.58*# 57.24±8.18 58.85±7.94 58.31±7.14 58.17±5.19 150.93±5.11*156.93±3.12*168.94±3.28*179.69±3.58*143.90±4.12*#152.91±5.11*#156.91±1.18*#168.68±2.94*#0.25±0.15 0.26±0.02 0.26±0.04 0.24±0.05 1.24±0.18*1.85±0.94*2.31±0.14*2.71±0.19*1.26±0.74*#1.44±0.12*#1.69±0.04*#2.12±0.78*#25.26±3.62 25.84±2.58 26.85±0.75 25.66±0.84 46.26±5.09*51.15±5.11*58.12±5.03*63.81±4.79*40.89±5.17*#45.64±5.03*#47.18±5.02*#52.82±4.21*#

图1 HE染色后观察兔肝组织纤维化Figure 1 Observation of hepatic fibrosis in rabbits after HE staining

表2 三组兔术后8 d 肝组织中Smad2 和Smad4 mRNA表达水平 Table 2 Expressions of Smad2 and Smad4 mRNA in the liver tissues of rabbits in the three groups on the 8th day after operation ()

表2 三组兔术后8 d 肝组织中Smad2 和Smad4 mRNA表达水平 Table 2 Expressions of Smad2 and Smad4 mRNA in the liver tissues of rabbits in the three groups on the 8th day after operation ()

注: 与假手术组比较, *P<0.05; 与模型组比较, #P<0.05。

组 别 例数 Smad2表达 Smad4表达假手术组模型组给药组F 12 12 12 - -0.10±0.09 0.53±0.71*0.35±0.62*# 0.256 <0.001 0.11±0.08 0.52±0.44*0.33±1.17*# 0.278 <0.001 P值

图2 蛋白质印迹法检测各组实验兔肝组织中Smad2 和 Smad4 mRNA表达情况Figure 2 The expressions of Smad2 and Smad4 mRNA in the liver tissues of the experimental rabbits in each group were detected by Western blotting

3 讨论

TACE 能有效缓解患者临床症状，并延长生存期，适应证较广，创伤小，恢复快，费用低，已广泛使用于肝癌患者的治疗[13]。但一些学者[14]认为，TACE 在治疗肝癌的过程中仍存在诸多弊端，例如在化疗栓塞过程中，部分化疗药物渗入非病灶区域，会造成非病灶区域的肝组织坏死，形成纤维化，严重时可导致急性肝衰竭发生，甚至患者在短期内死亡。

PGE1 是一种内生炎性反应活性物质，是花生四烯酸在环氧化合酶作用下生成的小脂质分子，广泛参与炎性反应发生及其调节过程[15]。研究表明，在器官纤维化过程中PGE1 可作用于前列腺素4 受体，抑制病灶中巨噬细胞的聚集，起到抗纤维化的作用[16]。Sajiki等[17]研究发现，PGE1还能与前列腺素2 受体结合，该过程生成的环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)能抑制TGF-β1 生成，而且纤维化组织中TGF-β1高表达时，cAMP表达水平也同步升高，这提示PGE1 能负反馈抑制TGF-β 生成，起到抗纤维化作用。

本研究在兔模型中探讨PGE1 对肝纤维化的拮抗作用。实验结果显示：给药组和模型组兔各时间点的血清学指标均明显升高，但模型组较给药组的指标升高更明显，其中HA、LN、PC Ⅲ和Ⅳ-C 等因子均与肝纤维化过程高度相关；该结果表明PGE1 对肝纤维化过程起到一定的抑制作用。分析其原因，这可能与PGE1 通过碘化油扩散至病灶中，病灶内PGE1 保持高浓度时，能通过作用于前列腺素1 受体激活抗氧化应激防御系统，减少脂质过氧化发生，从而降低过氧化对肝组织的损伤程度相关；另外，PGE1 还能下调系膜细胞增殖及细胞外基质合成功能，减少病灶内胶原纤维数量，起到肝纤维化保护的作用。本研究进一步对病理标本观察发现，模型组兔肝脏病理学标本的纤维化程度明显高于给药组，这也证实了PGE1 能起到抗纤维化作用。

肝纤维化发生时，肝组织内成纤维细胞增殖，产生胶原纤维等分子，替代坏死肝细胞。有关肝纤维化分子机制的研究是近年来的研究热点，通常认为TGF-β/Smad 通路与该过程高度相关[18]。TGF-β1 可与细胞膜上TGF-β 型受体(TβR)结合，激活肝星状细胞。肝星状细胞激活后能上调Smad 蛋白表达和分泌，后者可调节细胞外基质的产生过程[19]。既往动物实验研究发现，抑制Smad 蛋白表达可以有效抑制胶原纤维，特别是对Ⅰ型胶原沉积过程有明显的抑制作用，故认为Smad 蛋白的分泌和肝纤维化有直接联系[20]。

本研究进一步探究了PGE1 在改善家兔肝纤维化过程中是否对Smad2 和Smad4 mRNA表达水平有影响，结果显示：给药组和模型组家兔的Smad2 和Smad4 mRNA表达水平明显升高，而且给药组较模型组兔的肝组织中Smad2 和Smad4 mRNA表达水平明显降低；这证实了Smad2 和Smad4 mRNA 与肝纤维化过程有关联。上述结果表明，PGE1 抗肝纤维化作用与Smad2 和Smad4 mRNA表达水平改变相关联，推测其可能的机制有：PGE1 是一种炎性反应因子，具有抑制细胞免疫反应的作用，在TACE 过程中能减少肝细胞损伤，抑制肝细胞变性及水肿发生，同时可改善局部病灶微循环功能，起到保护肝功能的作用，从而抗纤维化发生；已知TGF-β1/Smad 通路是纤维化发生的重要通路，PGE1 通过作用细胞外受体产生cAMP 信号分子，在TGF-β1 高表达时cAMP 能抑制TGF-β1表达，故PGE1 抑制了炎性因子TGF-β1 的表达，进而抑制了TGF-β1/Smad通路，下调Smad2 和Smad4表达，起到了肝硬化保护的作用。

综上所述，PGE1 应用于肝动脉碘化油栓塞术，能改善术后肝纤维化情况，降低肝组织内Smad2 和Smad4 mRNA表达水平，对肝损伤保护有一定的积极作用。