骆驼奶对DSS 诱导的小鼠急性肠炎的保护作用

2020-07-04 07:41崔畅婉孙峥嵘
实验动物与比较医学 2020年3期
关键词:灌胃肠炎骆驼

崔畅婉, 于 淼, 王 爽, 吴 思, 孙峥嵘

(中国医科大学附属盛京医院生物样本库, 沈阳 110001)

骆驼处于干旱的荒漠地区,并能在如此恶劣环境中把盐碱含量高的粗硬植物转化为营养含量极高的乳、肉[1]。骆驼奶中含有丰富的蛋白质,而且对牛乳过敏的人不会对骆驼奶产生类似的过敏症状,食用更安全[2]。研究[3]表明,骆驼奶能够通过调节T 细胞分化和细胞因子分泌,纠正失衡的机体内环境,在哮喘、糖尿病、肝炎的治疗过程中起到辅助作用。目前,骆驼奶对炎性肠病患者肠道的黏膜免疫功能是否具有调节作用,能否缓解肠道炎症的疾病进程,其机制尚不明确。本实验采用葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate, DSS)诱导的急性小鼠肠炎模型,通过灌胃给药方式给予骆驼奶,检测小鼠肠道淋巴细胞分泌的细胞因子含量,探讨骆驼奶对小鼠肠炎的影响,有望为临床应用骆驼奶辅助治疗炎性肠病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、材料和试剂

SPF 级雄性C57BL/6 小鼠32 只, 6~8 周龄,16~18 g,由华阜康生物科技有限公司提供[SCXK(京)2014-0004],饲养于本单位实验动物设施[SYXK(辽)2013-0007]。DSS、 Percoll 细胞分离液均购自美国Sigma 公司,RPMI-1640 培养基购自美国Gibco 公司,抗鼠 CD4-异硫氰酸荧光素(FITC)、CD44-藻红蛋白(PE)、γ 干扰素(IFN-γ)-多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(Percp)、白细胞介素17α(IL-17α)-藻蓝蛋白(APC)和IL-4-Percp 均购自美国BD 公司,酶联免疫吸附试验试剂盒购自美国R&D 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 生存率和体质量影响实验 20 只小鼠随机分为实验组和对照组各10 只,肠炎诱导前14 d持续进行灌胃操作。实验组每只小鼠灌胃骆驼奶0.2 g/次(溶于200 µL 双蒸水),对照组小鼠灌胃双蒸水 200 µL/次,并于自由饮用DSS 诱导肠炎时终止灌胃操作。实验组和对照组小鼠均在饮用水中注入3% DSS 以诱导急性肠炎模型。开始饮用DSS 诱导肠炎记为0 d,记录至对照组小鼠全部死亡共7 d。

1.2.2 肠炎炎性指标影响实验 12 只小鼠随机分为实验组和对照组各6 只,肠炎诱导前14 d 持续进行灌胃操作,方法同1.2.1。实验组和对照组小鼠均以3% DSS 诱导急性肠炎。前期预实验发现,DSS 诱导5 d 起实验组小鼠体质量与对照组比较差异有统计学意义,诱导6 d 和7 d 小鼠死亡率过高。因此在诱导5 d 时以断颈法处死小鼠,并取结肠至肛门部位肠管进行后续病理学观察(HE 染色)、流式细胞术实验和ELISA 实验。

1.2.3 病理学观察 取0.5 cm 肠管中段浸于体积分数10% 的甲醛溶液中固定,并以梯度乙醇脱水,二甲苯透明,以及浸蜡制备蜡块。用切片机切片,厚度5 µm,45 ℃水浴展片,56 ℃烘片,脱蜡并进行HE 染色。病理学观察和评分判断炎性细胞浸润情况。上皮细胞评分:0,正常;1,部分杯状细胞损伤;2,大面积杯状细胞缺损;3,隐窝损伤;4,大面积隐窝缺失。浸润情况评分:0,正常;1,浸润隐窝基底;2,浸润至黏膜肌层;3,广泛浸润黏膜肌层,黏膜增厚,水肿明显;4,浸润达黏膜下层。组织学评分=上皮细胞评分 +浸润情况评分。

1.2.4 提取小肠固有层淋巴细胞 断颈法处死小鼠,75%乙醇溶液消毒,沿腹中线剪开小鼠腹部皮肤及黏膜组织,取出肛门至盲肠段肠管并清洗干净,剪碎后转移到50 mL 离心管中。向离心管中加入RPMI-1640 培养液35 mL,37 ℃培养20 min;用纱布过滤,转移至新的50 mL 离心管中离心(3 000 r/min, 2 min),弃去上清液并以8 mL 45% 密度梯度分离液分离细胞,将细胞悬液慢慢加入已放入5 mL 66.6% 硅石胶态悬浮液(Percoll)的15 mL 离心管中离心(1 200 r/min,15 min);回收上清液,并用RPMI-1640 细胞培养液重悬。

1.2.5 流式细胞术分析 向小鼠肠黏膜固有层淋巴细胞培养上清液中加入丙二醇甲醚醋酸酯(PMA,25 ng/mL)、离子霉素(ionomycin, 1 µg/mL)以及布雷非德菌素A(brefeldin A, 10 µg/mL),在37 ℃刺激培养5 h 后回收细胞,加入CD4-FITC 和CD44-PE 进行表面染色,之后将细胞破膜固定,再分别加入IFN-γ-Percp、IL-17-APC 和IL-4-Percp,4 ℃孵育30 min,之后5 500 r/min 离心1 min,弃掉上清液后重悬。用流式细胞仪进行检测,使用FlowJo 7.6 软件进行分析。

1.2.6 酶联免疫吸附试验 将2×105个/mL小鼠黏膜固有层淋巴细胞接种于包被了抗CD3 单克隆抗体的细胞培养板(200 µL/孔),加抗CD28 单克隆抗体并培养48 h,加捕获抗体过夜;第2 日封闭后加入标准品和样品50 µL/孔,室温避光2 h;加入检测抗体后,加辣根过氧化物酶50 µL/孔,避光20 min;加入底物后20 min 加终止液,上机检测吸光度。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 骆驼奶提高肠炎小鼠生存质量

实验组小鼠体质量下降缓慢,平均体质量高于对照组(P<0.05)(图1)。诱导7 d 对照组小鼠均死亡,而实验组小鼠仍然有生存(图2)。

2.2 骆驼奶减轻DSS 诱导的小鼠肠道炎性反应

图1 小鼠经DSS 诱导的体质量变化Figure 1 Changes of body weight of mice induced by DSS

图2 经DSS 诱导的急性肠炎小鼠生存率Figure 2 Survival rate of acute colitis mice induced by DSS

实验组和对照组小鼠结直肠均出现上皮结构不完整,隐窝消失及炎细胞浸润,但实验组小鼠组织学评分明显低于对照组(P<0.05)(图3)。流式细胞术胞内染色结果显示,实验组小鼠CD4+IFN-γ+细胞所占百分比(10.98%±1.47%)高于对照组小鼠(5.79%±0.92%),差异有统计学意义(P<0.05);CD4+IL-17+细胞所占百分比(1.35%±0.07%)低于对照组小鼠(3.64%±0.09%)差异有统计学意义(P<0.05)。酶联免疫吸附试验结果表明,与对照组相比,实验组小鼠肠道黏膜固有层淋巴细胞培养上清液中IFN-γ 含量增高(P<0.05),TNF-α 和IL-17 水平降低(P<0.05)(表1)。

图3 DSS 诱导急性肠炎小鼠结肠HE 染色及病理组织评分Figure 3 HE staining and pathological tissue score of colon in acute colitis mice induced by DSS

表1 小鼠结肠黏膜固有层细胞培养上清液中IFN-γ、IL-17 和TNF-α 含量Table 1 Levels of IFN-γ,IL-17 and TNF-α in the supernatant of lamina propria cells of mouse colon mucosa [ρ/(µg·mL-1), ]

表1 小鼠结肠黏膜固有层细胞培养上清液中IFN-γ、IL-17 和TNF-α 含量Table 1 Levels of IFN-γ,IL-17 and TNF-α in the supernatant of lamina propria cells of mouse colon mucosa [ρ/(µg·mL-1), ]

注: 与双蒸水对照组比较, *P<0.05。

组别 IFN-γ IL-17 TNF-α对照组11.64±1.48 17.35±2.02*14.73±1.59 10.86±0.71*实验组0.82±0.04 0.46±0.03*

3 讨论

炎性肠病近年来发病率持续上升,发病机制包括环境、遗传和免疫等多种因素。目前,临床治疗多以水杨酸制剂、激素类以及免疫抑制剂治疗为主,长期使用的不良反应明显,因此探究新的治疗手段具有重要意义。炎性肠病与Th1/Th2 细胞比例失衡有关,Th1 细胞是Th0 细胞在IL-12 等细胞因子作用下分化而成,主要分泌IL-2、IFN-γ 和TNF-α。Th17 细胞可分泌的细胞因子包括IL-17A、IL-17F 和IL-21 等,在多种自身免疫性疾病中起促炎作用[4]。研究[5]显示,骆驼奶中不饱和脂肪酸比例较牛奶高,机体不饱和脂肪酸含量与糖尿病发生率呈负相关,糖尿病患者中TNF-α mRNA 呈增高趋势,饮用骆驼奶可降低体内TNF-α 的含量,进而改善糖尿病患者糖脂代谢紊乱症状。骆驼奶中具有抗癌活性成分,研究证实,饮用骆驼奶可抑制多种癌细胞的增殖,如人乳腺癌、喉癌等[6-7]。骆驼奶中含有的乳铁蛋白和溶菌酶可以通过直接抑制病原体入侵感染,增强局部Th1 反应,从而增强免疫调节功能[8-9]。骆驼奶及其奶制品中含有双歧杆菌和乳酸杆菌等益生菌。双歧杆菌和乳酸杆菌能够抑制Th2 型细胞增殖,促进Th1 型细胞增殖,并且有利于丝状细菌、梭状芽胞杆菌和脆弱类杆菌生长,从而增加调节性T 细胞免疫应答[10-11]。

目前,建立炎性肠病动物模型的方法主要是通过外源性化学物质诱导,包括恶唑酮、三硝基苯磺酸及DSS[12-13]。本研究以DSS 诱导的C57BL/6小鼠肠炎模型为研究对象,模拟人肠道环境,探究骆驼奶对肠道黏膜免疫的影响。与双蒸水对照组比较,骆驼奶实验组小鼠体质量下降缓慢,生存率提高,组织学评分下降,表明骆驼奶对小鼠急性肠炎有缓解作用。流式细胞术胞内染色结果显示,骆驼奶能促进Th1 型细胞分化,抑制Th17型细胞分化。Th17 及其分泌的IL-17 是促进自身免疫性疾病发病的重要因素,炎症性肠病患者血清中Th17 水平较正常人高,并与病程呈正相关[14-15]。灌胃骆驼奶抑制Th17 细胞分化,证明骆驼奶通过调节T 细胞亚群增殖和分化,缓解肠炎症状。Th1 型细胞能够辅助细胞毒性T 细胞分化,进而介导细胞免疫应答。溃疡性结肠炎部分患者的肠道黏膜中Th1/Th2 比例失衡。本实验证明骆驼奶促进Th1 型细胞分化,上调其分泌的细胞因子IFN-γ 水平,有助于缓解疾病进展。酶联免疫吸附试验结果显示,小鼠肠黏膜固有层细胞分泌IL-17 和TNF-α 水平降低,而IFN-γ 水平升高。IFN-γ 具有免疫调控作用,它可以调控多个基因表达水平,增强自然杀伤细胞活性[16],而这些作用在人胃肠道稳态维持过程中起重要作用。灌胃骆驼奶后,小鼠体内IFN-γ 水平增高而IL-17 和TNF-α 水平下降,证明骆驼奶能够调节小鼠肠道细胞因子分泌,进而缓解肠炎进展,为骆驼奶辅助临床治疗炎性肠病提供了新的依据。综上所述,本研究证明,骆驼奶能够调节DSS 诱导的急性肠炎小鼠肠道黏膜免疫细胞的比例,促进Th1 细胞分化,抑制Th17 细胞分化,促进细胞因子IFN-γ 分泌,抑制IL-17 和TNF-α的分泌。本研究结果为骆驼奶临床辅助治疗炎性肠病提供了新的可能性。

猜你喜欢
灌胃肠炎骆驼
冬季鸡肠炎易发 科学防治有方法
大骆驼
生大黄及轻质液状石蜡灌胃治疗急性胰腺炎的临床分析
骆驼
小鼠、大鼠灌胃注意事项
藏医治疗慢性肠炎
藏药六味肠炎灵治疗肠炎临床疗效观察
一种简易的实验兔灌胃方法
小鼠最大灌胃量的研究
彷徨的骆驼