一种消毒剂急性眼刺激性猪角膜试验检测方法的建立

李 敏, 李光先, 李培宁, 陈梓灵, 刘 颖, 朱素珍, 庞增雄, 刘冬虹, 刘香梅

(广州质量监督检测研究院, 广州 511447)

《消毒技术规范》(2002 版)中消毒产品安全性评价之一的急性眼刺激性试验，是采用活体动物进行试验，会对活体动物造成不可逆的损伤，不符合社会公众极大关注的减少(reduce)、优化(refine)、替代(replace)的“3R”原则。在化妆品和化学品毒理安全性评价领域，眼刺激性评价目前应用较多的是牛角膜混浊与通透性(bovine corneal opacity and permeability, BCOP)试验[1-2]。但猪角膜在生理及反应结果方面与人角膜更为接近，另外，东方人的饮食习惯和宗教信仰等原因导致获取牛角膜有一定难度，如果将此方法结合中国消费习惯进行改进，用猪眼代替牛眼在消毒产品领域进行试验检测，是可行的[3-5]。

因此，本文应用猪角膜，进行眼刺激性体外试验条件的探索，建立消毒剂猪角膜眼刺激性检测方法，期望用于消毒产品眼刺激安全性的评价。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂与仪器

猪眼球购自广东壹号食品有限公司。牛眼球购自广州市华代生物科技有限公司。新鲜离体眼球浸泡于冰冷的Hank's平衡盐溶液(HBSS)内运回实验室。

含酚红的MEM 培养基、无酚红的MEM 培养基、HBSS 缓冲溶液、胎牛血清和杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS，含钙镁离子)均购自美国Gibco 公司；荧光素钠和咪唑均购自美国Sigma 公司；无水乙醇购自广州化学试剂厂；生理盐水(0.9%氯化钠溶液)购自江西科伦药业有限公司。角膜浊度仪购自德国BASF 公司；多功能酶标仪购自美国赛默飞公司；恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

参考欧洲经济合作和发展组织(OECD)指南中BCOP 试验，探究无水乙醇和20%咪唑溶液(用0.9%的氯化钠溶液配制)2 种阳性物的暴露时间和孵育时间，使其猪角膜体外刺激评分(in vitro irritancy score，IVIS)处于各自对应的标准区间内(乙醇39.2~64.1，咪唑68.8~129.9)。

1.2.1 分离和装配角膜 从新鲜眼球上完整切下角膜，周边保留 2~3 mm 巩膜，将其装配在角膜支架中。前后室均填满无酚红的ME M 培养液，于32 ℃培养箱中平衡1 h，更换前后室培养液后，用浊度仪读取角膜本底浊度(OP)值(即初始OP)。

1.2.2 暴露 分为液体和固体受试物两类，液体受试物采用无水乙醇作为阳性工具，固体受试物采用20%的咪唑作为阳性工具，移除前室培养液后加入750 µL 无水乙醇或20%咪唑，于培养箱中分别暴露不同时间(无水乙醇暴露时间为6 min、8 min、10 min、12 min 和14 min，咪唑暴露时间为2 h、3 h、4 h、5 h 和6 h)，充分清洗后，将前室重新填满无酚红的MEM 培养液。无水乙醇组培养箱继续孵育2 h 后读取OP 值(即末次OP)，咪唑组直接读取OP 值(即为末次OP)。

1.2.3 OP 和渗透性检测 去除前室培养液，加入1 mL 0.4%液体受试物或0.5%固体受试物(由含Ca2+和Mg2+的DPBS 配制的荧光素钠溶液)，分别孵育50 min、60 min、70 min、80 min、90 min、100 min、110 min、120 min 和130 min 后收集后室全部液体，混匀后取360 µL 在490 nm 波长下读取吸光度(A)值 。以生理盐水为阴性对照。当校正OP 变化值接近乙醇或咪唑的IVIS 范围时，取当前暴露时间段进行进一步调整优化(包括孵育时间)，使各自的IVIS 处于标准范围内。

1.2.4 试验条件验证 方法建立后，选取液态消毒剂和固态消毒剂分别作用于猪角膜和牛角膜，进行验证。

1.3 统计学方法

计算OP 变化值(△OP=初始OP-末次OP)、校正OP 变化值(OPCor.= △OP阳性-△OP阴性对照)和校正A 值(ACor= A阳性-A阴性对照)，并计算IVIS(IVIS=OPCor+ 15×ACor)。每个时间点设3 个平行，重复3 次实验。数据以表示，不同组间比较采用SPSS 20软件进行ANOVA 方差分析，P ＜0. 05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 试验条件探索

2.1.1 暴露时间探索 随着乙醇暴露时间增加，A值和IVIS 值相应增加(表1)。乙醇暴露10~14 min，IVIS 均在体外评分范围。因此，选择暴露时间10 min 进行下一步孵育时间的探索。

表1 乙醇暴露不同时间的IVIS探索 Table 1 IVIS exploration with different exposure times of ethanol (, n=3)

表1 乙醇暴露不同时间的IVIS探索 Table 1 IVIS exploration with different exposure times of ethanol (, n=3)

注: OPcor为角膜本底浊度校正值, A为490 nm波长下吸光度, IVIS 为体外刺激评分。

作用时间/min OPCor A IVIS 6 8 10 12 14 29.67±0.89 33.89±0.45 36.58±0.44 43.56±0.87 54.36±0.31 64.93±0.64 0.11±0.03 0.14±0.04 0.18±0.04 0.21±0.06 0.28±0.05 0.53±0.07 31.32±2.03 35.99±1.78 39.28±1.23 46.71±1.43 58.56±2.35 72.88±2.78 16

随着咪唑暴露时间增加，A 值和IVIS 值相应增加。暴露3~5 h，IVIS 均在咪唑的体外评分范围，详见表2。因此，选择暴露时间3 h 进行下一步孵育时间的探索。

表2 咪唑暴露不同时间的IVIS探索 Table 2 IVIS exploration with different exposure times of imidazole (,n=3)

表2 咪唑暴露不同时间的IVIS探索 Table 2 IVIS exploration with different exposure times of imidazole (,n=3)

注: OPcor为角膜本底浊度校正值, A为490 nm波长下的吸光度, IVIS 为体外刺激评分。

作用时间/h OPCor A IVIS 2 3 4 5 6 53.23±2.32 75.45±2.56 93.87±1.26 112.21±2.37 131.36±3.50 0.25±0.10 0.30±0.12 0.31±0.08 0.35±0.09 0.38±0.07 56.98±2.30 79.95±2.54 98.52±3.69 117.46±4.25 137.06±3.21

2.1.2 孵育时间探索 在乙醇暴露10 min 和咪唑暴露3 h 后，进行猪角膜孵育。由表3 可看出，乙醇组在孵育80 min 后A 值不再增加，咪唑组孵育70 min 后A 值不再增加。因此选择以上两个时间进行下一步探索验证。

表3 乙醇、咪唑暴露后不同孵育时间的A 值Table 3 Absorbance values at different incubation times after exposure to ethanol and imidazole (, n=3)

表3 乙醇、咪唑暴露后不同孵育时间的A 值Table 3 Absorbance values at different incubation times after exposure to ethanol and imidazole (, n=3)

作用时间/min 乙醇组 咪唑组 50 60 70 80 90 100 110 120 130 0.15±0.02 0.18±0.04 0.18±0.05 0.19±0.03 0.19±0.01 0.19±0.04 0.19±0.03 0.19±0.03 0.19±0.01 0.30±0.10 0.31±0.08 0.32±0.09 0.32±0.07 0.32±0.08 0.32±0.05 0.32±0.06 0.32±0.05 0.32±0.08

表4 不同形态消毒剂作用下猪、牛角膜的IVISTable 4 IVIS of pig and bovine cornea under the action with different forms of disinfectant (, n=3)

表4 不同形态消毒剂作用下猪、牛角膜的IVISTable 4 IVIS of pig and bovine cornea under the action with different forms of disinfectant (, n=3)

组 别 猪角膜 牛角膜无水乙醇液态消毒剂生理盐水(阴性对照)咪唑固态消毒剂生理盐水(阴性对照)40.15±3.68 2.69±1.02 2.54±0.76 72.59±2.13 10.25±1.56 2.85±0.31 42.80±2.56 2.57±1.19 2.28±0.58 74.05±3.92 9.31±2.87 2.68±0.49

2.2 试验条件验证

液态消毒剂暴露10 min、孵育80 min，固态消毒剂暴露3 h、孵育70 min 后，猪角膜IVIS与牛角膜IVIS 相比，差异无统计学意义(P>0.05，表4)。

3 讨论

从1990 年代开始，眼刺激的动物实验替代方法陆续进入验证程序。2009 年，BCOP 试验被OECD 认可，列入化学品毒性测试指南的眼刺激替代方法(TG437)。至今，有效的和法规认可的眼刺激替代方法共有8 项[1]。2015 年，OECD 起草了用于眼刺激性测试和评估的整合方法，并于2017 年7 月20 日正式发布指南263[6]。该方法详细说明了BCOP 等替代方法在眼刺激性评估中的应用，该标准方法具有快速、简便和不受样品限制等优点，可单独或组合用于化学品、个人护理品配方和成品、抗菌产品、家居护理品等的单次眼刺激性预测[7-10]。

本研究创新性地采用离体猪角膜进行消毒产品的眼刺激性毒性测试探索，分别应用BCOP 试验的两种阳性物作为探索工具，探索最佳试验条件。在暴露时间探索中可看出暴露时间越长，OP 值越大，角膜从“透亮”越发“发白”，提示角膜上皮基质可能发生蛋白变性，导致透光性减弱，阳性效果显著。孵育时间90 min 的前提下，从表1和表2 可筛选出较合适的乙醇和咪唑暴露时间分别为10~14 min 和3~5 h，这时的IVIS 与质控体外评分范围接近。本着效率原则，选取10 min 和3 h进行下一步渗透性孵育时间的探索。对于渗透性指标，A 值用于评价角膜上皮层的完整性[11]。由表3 可以看出短时间内，A 值随时间递增而增加，乙醇组80 min、咪唑组70 min 后A 值不再增加，提示角膜上皮层可能已经破坏，渗透达到峰值。基于猪角膜面积小于牛角膜面积，故暴露时间小于10 min 和4 h 使角膜损坏是可能的。

本研究将2 种消毒剂盲样按照以上试验条件同时作用于猪角膜和牛角膜，得到对应的IVIS，由表4 可以看出同一物质同时作用猪角膜和牛角膜的IVIS 无显著差异，因此该试验条件下能应用于消毒产品的体外替代检测。

本研究建立的消毒产品眼刺激性试验体外检测方法，是BCOP 测试方法的进一步创新，对消毒产品体外眼刺激毒理安全性评价可能具有重要意义。