冈田酸对斑马鱼幼鱼神经行为功能的影响

王 雪, 刘可春, 杨学亮, 马玉奎, 张 云

[1. 齐鲁工业大学(山东省科学院)生物研究所, 济南 250103;2. 山东省人类疾病斑马鱼模型与药物筛选工程技术研究中心, 济南 250103;3. 山东省药学科学院, 山东省化学药物重点实验室, 济南 250101]

神经退行性疾病是由多种因素引起神经元或其髓鞘丧失，并呈进行性恶化，从而使患者出现功能障碍，如阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)。AD 以智力减退为主要特征。研究表明，淀粉样蛋白沉积、tau 蛋白过度磷酸化和胆碱能神经元缺失是AD 的3 个主要特点[1]。过去人们认为，AD 只是局限于中枢神经系统的病变；后来研究发现，AD 的发病机制包括中枢和外周两个方面，整个机体系统与AD 发生密切相关；而且有研究者[2]发现，利用药物靶点干预清除外周β-淀粉样蛋白(amyloid β，Aβ)对缓解AD 发展同样有效，因此人们逐渐从全身角度探讨AD 的发生机制，并制定诊断和治疗策略。当前临床上尚没有能彻底根治AD 的药物，但是一些能延缓AD 发展的药物已得到应用，并取得了良好的效果。例如，美国食品药品监督局(F o o d a n d D r u g Administration，FDA)批准上市的4 种胆碱酯酶抑制药物加兰他敏、克林、利斯和多奈哌齐，以及N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate，NMDAR)阻断药物美金刚[3]。另外，针对疾病不同靶点，如组胺能系统、γ-氨基丁酸能系统、5-羟色胺系统以及Aβ 活性的新药研究也正在开展。

斑马鱼是一种新型模式生物，具有繁殖力强、数量多、生长快、体型小和胚胎透明等特点，可以用来进行基因操作和大规模遗传突变筛选。斑马鱼与人类基因有较高相似度，而且在一些器官发育、功能特征及病变机制上与人类相似，因此，其常常被用于发育生物学、遗传学、药理学和生态毒理学等研究。在神经系统方面，斑马鱼的神经系统和主要神经核团与人类相似，其小脑保留了与人类相似的层状结构。有研究表明，斑马鱼与哺乳动物的基底神经节和纹状体具有高度同源性区域[4]。利用转基因荧光标记的方法，人们发现在2～3 月龄斑马鱼大脑中，大量并广泛表达淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)[5]，表明斑马鱼神经系统发育在进化上和人类有高度保守性。因此，斑马鱼也逐渐应用于神经发育、神经毒性及其他一些人类神经系统疾病研究。

冈田酸(okadaic acid，OA)属聚醚类海洋生物毒素，可特异性抑制蛋白磷酸酯酶，诱导Tau 蛋白过度磷酸化及神经细胞骨架变化，引起神经元细胞的纤维缠结、变性，从而引起认知缺陷，是AD造模的常用药物[6]。本研究探讨了OA 对斑马鱼神经行为功能的影响，为进一步促进斑马鱼模型在人类神经退行性疾病研究中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验所用为AB系野生型斑马鱼，来源于山东省科学院斑马鱼药物筛选平台，在水温28.5 ℃、14 h 光照/10 h 黑暗周期条件下养殖，每日于9∶00 和15∶00 喂食2 次颗粒饲料。排卵前日将斑马鱼成鱼按雌雄比例1∶1 放入具筛板的产卵缸内，中间放置隔板，次日亮灯前抽去隔板，在光照刺激下排卵。收集鱼卵，用培养液冲洗3 次，然后放入新培养水中，在28.5 ℃、相同光照条件下发育至受精3 d(3 days post fertilization，3 dpf)。

1.2 试剂与仪器

OA(相对分子质量为805，纯度≥99.0%)购自美国Sigma公司， 用二甲基亚砜(DMSO)溶解配制成储存液(OA 母液)；TRIzol 试剂购自美国Invitrogen 公司；PrimeScriptTM1st Strand cDNA合成试剂盒购自日本TaKaRa 公司；iTaq Universal SYBR Green Supermix 购自美国Bio-Rad 公司；其余试剂均为国产分析纯。

胚胎培养液成分为NaCl 5 mmol/L、KCl 0.17 mmol/L、CaCl20.4 mmol/L 和MgSO40.16 mmol/L，用去离子水配制。

荧光定量PCR 仪(型号CFX96)购自美国Bio-Rad 公司，倒置显微镜(型号IX51)购自日本Olympus 公司，MICCRA D-1 匀浆器购自德国ART 公司， Zebrabox 斑马鱼行为分析仪购自法国Viewpoint 公司，斑马鱼养殖饲养系统购自北京爱生科技发展有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 斑马鱼分组与给药 用6 孔板进行实验。将OA 母液用培养液稀释后，配制成0.05、0.10和0.20 µmol/L 的OA 溶液，加入6 板孔内，每孔终体积5 mL；对照组用含同等体积DMSO(体积分数≤0.5%)的培养液。将发育3 d(3 dpf)的斑马鱼幼鱼放入各孔内，每孔放30 条，每组设3 个平行复孔。加盖后，放于28 ℃光照培养箱中培养7 d，每24 h 更换1/2 体积的药物溶液，并观察记录幼鱼死亡情况，及时去除死亡幼鱼。

1.3.2 斑马鱼幼鱼行为学研究 处理结束后，将OA 组和对照组幼鱼分别放在24 孔板内，每孔放1 条幼鱼，将孔板放入行为学分析仪的暗箱内。使用ZebraLab 3.3 软件采集各组幼鱼的运动轨迹，每5 min 采集一次，连续采集30 min。根据软件测量幼鱼游行距离、游行速度及呆滞时间等行为学指标，比较幼鱼活动情况。

1.3.3 实时荧光定量PCR 检测 处理结束后，收集每组中存活幼鱼至1.5 mL 离心管，用灭菌水冲洗后，尽量吸净水分。每管分别加入TRIzol 试剂，匀浆，提取幼鱼组织的总RNA，并反转录成cDNA。取1 µL cDNA 产物进行实时荧光定量PCR，检测各组斑马鱼幼鱼组织中蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)和α7 烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor alpha 7，α7-nAChR)基因的表达情况。PCR 反应体系为20 µL，其中α7-nAChR 基因正向引物序列为5'-ATGACACCCACTCACTCACG-3'，反向引物序列为5'-TGGCGGTAAGTATTGGCAGG-3'；PP2A基因正向引物序列为5'-TCACGCTGCTGGTGTCTTTA-3'，反向引物序列为5'-CTGTGTGTCTACGAGGGCTG-3'；内参β-actin 基因正向引物序列为5'-CGCTGCCTCTTCTTCCTCC-3'，反向引物序列为5'-GATGTCCACGTCGCACTTCA-3'。PCR 反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，63 ℃30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 10 min。采用2-△△Ct法分析目的基因的相对表达量：△Ct ＝目的基因Ct 值－内参基因Ct 值，△△Ct ＝OA组△Ct－对照组△Ct，以2-△△Ct表示OA 组目的基因的表达倍数。

1.4 统计学分析

运用SPSS 13.0 软件对实验数据进行分析。各组均值用表示。采用独立样本t 检验比较组间差异，P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 OA 对斑马鱼幼鱼存活率的影响

3 dpf 斑马鱼幼鱼在不同浓度OA 溶液中处理7 d 后，0.05 µmol/L 和0.10 µmol/L OA 组的幼鱼存活率与对照组相比，均无明显差异(P 值均＞0.05)。0.20 µmol/L OA处理后幼鱼存活率降低为(73.67±4.60)%，与对照组的(90.54±3.90)%相比，明显降低(P ＜0.05，图1)。另外，幼鱼未出现明显的表型异常。

2.2 OA 处理后斑马鱼幼鱼的行为学变化

图1 不同浓度OA 处理对斑马鱼幼鱼存活率的影响Figure 1 Survival rate of zebrafish larvae treated with different concentrations of okadaic acid (OA)

对照组斑马鱼幼鱼游动活跃，游动距离较长。0.05 µmol/L 和0.10 µmol/L OA 组幼鱼游动轨迹与对照组无明显差别(图2)，0.20 µmol/L OA组的幼鱼游动活力明显下降，游动距离比对照组明显缩短(P ＜0.05，图3A)，呆滞时间则比对照组明显延长(P ＜0.05，图3B)。

2.3 OA 对斑马鱼幼鱼体内神经功能相关基因表 达的影响

0.20 µmol/L OA 处理7 d 后，斑马幼鱼体内PP2A 基因表达水平明显降低(P ＜0.05)，而α7-nAChR 基因的表达水平与对照组相比无明显改变(图4)。

图2 不同浓度OA 处理后的斑马鱼幼鱼30 min 内游动轨迹Figure 2 Swimming trajectory of zebrafish larvae treated with different concentrations of okadaic acid (OA) within 30 min

图3 不同浓度OA 处理组斑马鱼幼鱼30 min 内游动距离(A)和呆滞时间(B)Figure 3 Swimming distance (A) and sluggish time (B) of zebrafish larvae treated with different concentrations of okadaic acid (OA) within 30 min

图4 OA 对斑马鱼幼鱼体内PP2A 与α7-nAChR 基因表达的影响Figure 4 Expression levels of protein phosphatase 2A (PP2A) and nicotinic acetylcholine receptor alpha 7 (α7-nAChR) genes in zebrafish larvae after treatment with okadaic acid (OA)

3 讨论

行为学实验是在整体水平上动态研究生命活动的特征，能直观检测控制因子在生命体内的作用[7]，这是斑马鱼实验研究中的重要内容。应用行为分析系统可准确追踪斑马鱼成鱼或幼鱼的运动轨迹，采用T 迷宫、Y 迷宫、条件性位置偏爱社交等行为学实验可以进行斑马鱼成鱼认知和学习能力的测量[8]。Winter 等[9]采用Viewpoint Video track for ZebrafishTM系统分析幼年斑马鱼的运动轨迹，定义慢速游动(＜5 mm/s)、中速游动(5～20 mm/s)和快速游动(＞20 mm/s)3 种状态，通过计算快速游动在整个运动期间所占的百分比，评价戊四唑对幼年斑马鱼癫痫发作的诱导作用。马佶等[10]以斑马鱼幼鱼游动距离和游动速度为比较指标，分析天麻药材和天麻素在发挥镇静安神作用方面的差异。相比于其他模型，斑马鱼体格小，数量多，便于开展高通量实验筛选。Rihel 等[11]对5 648 种小分子化合物处理后的幼鱼行为进行记录监测，收集涵盖行为变化维度和量化参数的行为学图谱，并与相应化合物的种类及结构进行关联分析，发现相同种类化合物产生的行为学特征具有相关性，具有相同生物靶点的化合物会产生相似、保守的行为学表型。因此，行为学特征能揭示化合物与靶点间的联系，预测未知化合物的作用机制。行为学结果也表明，神经递质通路中主要调节因子对斑马鱼睡眠/觉醒状态下行为的影响与对哺乳动物的影响相似，揭示了不同物种间神经因子功能在进化上具有保守性。

OA 可选择性抑制蛋白磷酸酶，使tau 多个位点过度磷酸化[12]，产生神经毒性，可以模拟AD的病理过程。本实验用0.20 µmol/L 的OA 溶液处理3 dpf 斑马鱼幼鱼7 d，与对照组比较，幼鱼出现游动减少、游动距离缩短、呆滞时间延长等明显行为异常表现，并呈现剂量依赖性特点，表明OA 处理对幼鱼神经产生毒性影响，造成斑马鱼神经行为功能障碍。

4 种类型的人脑磷酸酶中，PP2A 活性最强[12]。PP2A 是脑内丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族中的一员，PP2A/Bα 亚基与tau 蛋白结合，是主要的tau 蛋白磷酸化酶。已有研究[13]发现，AD 患者脑中PP2A 活性明显下降。体外实验中，OA 选择性抑制蛋白磷酸酶活性，且对PP2A 的作用最强[12]。本研究中，对PP2A 催化亚基(NM_001017886)的基因表达水平进行检测时发现，0.20 µmol/L 的OA 处理7 d 后幼鱼PP2A 基因表达水平比对照组明显下降，说明OA 可以从基因转录水平降低斑马鱼体内PP2A 的活性，导致幼鱼神经行为功能障碍的发生。

α7nAChR 广泛分布在大脑皮质、皮层下边缘区、海马、丘脑及基底神经节等部位，通过作用于突触前膜、突触后膜、突触周围或突触外等部位发挥功能，能调节神经元兴奋性，可使神经元处于一种合适的生理状态，维持正常的行为反应(尤其是认知功能)，与多种精神疾病具有相关性[14]。研究[14]还发现，AD 患者脑区α7nAChR水平明显下降，其下降水平与AD 患者认知能力降低程度密切相关。斑马鱼体内有9 种神经元nAChR，其序列与其他脊椎动物相似。在斑马鱼发育早期，α7nAChR 在后脑即有表达[15]。本研究中，对α7nAChR(AY247962)基因表达水平进行检测时发现，OA 处理组幼鱼的α7nAChR表达水平相较于对照组无明显改变，表明α7nAChR 在OA导致的斑马鱼神经病变中作用不明显。Papke 等[15]研究发现，人体内选择性作用于α7nAChR 的激动剂在斑马鱼脑内未得到相应的活性验证，这也说明斑马鱼神经系统内虽然有α7nAChR 的表达，但其作用机制与人类有较大差异。

动物模型是进行人类神经退行性疾病研究的重要工具。斑马鱼发育周期短，并可以通过水溶性的给药方式进行药物干预，因此在模型建立、数据分析及活性药物筛选方面均表现出胜于其他模型的独特优势。目前，斑马鱼基因组测序已完成，在胚胎期易于开展基因编辑操作，尤其适用于遗传因素相关的神经退行性疾病的研究。因此，斑马鱼在神经退行性疾病研究方面具有广阔的应用前景。根据人类疾病的机制与特点，建立相应的斑马鱼模型及检测体系，将为下一步开展活性治疗药物的快速筛选工作奠定基础。