三类病毒性新发传染病动物模型的研发及应用进展概述

李 峰, 李 顺, 任晓楠, 周晓辉

(1. 复旦大学附属上海市公共卫生临床中心，上海201508；2. 上海市新发与再现传染病研究所，上海201508)

近年来，冠状病毒、黄病毒和流感病毒等引起的新发传染病成为了严重危害人类生命健康的重要疾病。其中，冠状病毒是单正链RNA 病毒，具有高突变率特征，可导致人和动物呼吸系统感染和肠道感染。最近新冠病毒引起的全球疫情仍在进展中。另外，黄病毒科中的寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)和登革病毒(dengue virus，DENV)均是以蚊子为主要传播媒介的单正链RNA病毒，前者感染人可引起成人格林巴利综合征和新生儿小头症，后者感染可以引起登革热、登革出血热和登革休克综合征。而流感病毒属于正黏病毒科，为单负链RNA 病毒，是感染人和动物呼吸系统最主要的病原体之一。以下分别对这3类病毒的动物模型研究进展进行概述。

1 冠状病毒感染动物模型

目前发现可以感染人类的冠状病毒有7 种，其中3 种为高致病性的冠状病毒，包括严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)[1-3]。最近，SARSCoV-2 感染出现全球大流行，世界卫生组织将这一新型冠状病毒肺炎疾病命名为C O V I D-1 9(coronavirus disease 2019)[1-3]。

SARS-CoV-2属于正冠状病毒亚科β冠状病毒属。SARS-CoV-2 感染和传播机制与SARS-CoV相似，都是以人类细胞的血管紧张素转换酶Ⅱ(angiotensin converting enzyme Ⅱ，ACE2)作为受体[4-6]。已知有多种动物已经被用于构建SARS-CoV和MERS-CoV的易感或疾病动物模型，包括非人灵长类、雪貂、金黄仓鼠、新西兰白兔、免疫缺陷小鼠和野生型小鼠等[7-13]。目前，SARS-CoV-2 的动物模型研究策略基本上参考了SARS-CoV 和MERS-CoV 的易感或疾病动物模型，并取得了一定进展，具体见表1。

1.1 小鼠模型

目前有3 种策略用于冠状病毒感染小鼠模型的研发：第一种是使用野生型冠状病毒感染不同的小鼠品系(或亚系)，建立小鼠模型；第二种是使用基因修饰小鼠作为冠状病毒感染的动物模型；第三种是使用特定的小鼠品系进行病毒适应株的进化筛选后，再使用病毒适应株感染小鼠，建立合适的出现临床症状的小鼠模型。

研究证实，人 ACE2(hACE2)是SARS-CoV-2的受体[14]。秦川团队利用 hACE2 转基因小鼠建立SARS-CoV-2 感染模型，结果发现hACE2 转基因小鼠在感染SARS-CoV-2 后出现体质量减轻等症状，而且病毒主要在小鼠肺部复制；组织病理学表现为中度间质性肺炎，而且在支气管上皮细胞、巨噬细胞和肺泡上皮细胞中发现了病毒抗原[15]。

协作杂交系(collaborative cross，CC)小鼠是由一系列重组近交系小鼠按照严格的杂交育种方案(八亲本育种方案)杂交育种而成，可以模拟人类的种群遗传多样性。CC 小鼠可以作为一个非常好的遗传资源平台，用于新发和再发冠状病毒相关研究，也可作为SARS-CoV-2 感染的小动物模型[16-19]。

需要说明的是，以上这些小鼠模型不能完全模拟人体情况，研究者目前仍在探索更合适的SARS-CoV-2 感染小鼠模型。

1.2 仓鼠模型

仓鼠被SARS-CoV-2 感染后，出现体质量减轻、嗜睡、翘毛、驼背和呼吸急促等症状，而且在肺部和肠道发现高水平表达的SARS-CoV-2抗原。此外，将感染SARS-CoV-2 的仓鼠和未感染的仓鼠放在一起，未感染的仓鼠也会出现临床症状。SARS-CoV-2 存在飞沫传播和粪口传播的可能性[20-21]。

1.3 雪貂模型

SARS-CoV-2 可以感染雪貂，并能在上呼吸道复制长达8 d；但感染后的雪貂体温轻微升高，不会造成严重疾病或死亡[22-25]。

1.4 非人灵长类动物模型

对SARS-CoV-2 感染猕猴模型的研究发现，感染SARS-CoV-2 后猕猴病情轻微，体质量稍有减轻，但无体温升高现象，肺部显示与人相似的病理学症状[26-27]。秦川团队的研究得到了相似的结论，并且进一步发现SARS-CoV-2 在猕猴模型中存在结膜感染途径。随后，秦川等多个科学家联合团队又公布了有关SARS-CoV-2 灭活疫苗有效性和安全性的临床前研究结果，发现该疫苗在小鼠、大鼠和非人灵长类动物中均可诱导新冠病毒特异性中和抗体产生[28-29]。

另外，荷兰科研人员使用SARS-CoV-2 对8只食蟹猴进行感染试验，结果显示年长猴的鼻拭子和咽拭子中病毒载量比幼猴高；病理解剖发现，部分猴肺部明显受损，该结果与人的COVID-19 轻症很相似[30]。美国科研人员的研究也显示，SARS-CoV-2 可以引起受感染猕猴发生呼吸道疾病，且肺部X 线计算机断层摄影(CT)显示明显的病理变化；在所有猴的鼻拭子和咽拭子以及支气管灌洗液中均能检测到高水平的病毒载量[31]。中国医学科学院对比了SARS-CoV-2 感染3 种非人灵长类动物模型的试验结果，发现感染效果依次为猕猴＞食蟹猕猴＞狨猴[32]。

综上，猕猴和食蟹猕猴模型可用于评估治疗或预防COVID-19 的疫苗和药物。

2 黄病毒感染动物模型

黄病毒科中有很多病毒可以引起人类疾病，例如黄热病毒、西尼罗河病毒、ZIKV 和DENV等。后两者常由蚊子传播，近年来多次引起局部和大范围的疾病流行。ZIKV和DENV由正链RNA包被病毒衣壳而构成[33-34]。已知ZIKV感染可引起格林巴利综合征以及胎儿、新生儿小头畸形和先天畸形。DENV 有4 种血清型，在非洲、美洲、东地中海、东南亚和西太平洋地区100 多个国家引起登革热以及死亡率很高的登革出血热和登革休克综合征，并呈地方性流行。构建ZIKV 和

DENV 感染动物模型有利于探究以上疾病的发病机制以及宿主免疫反应机制，并用于评估新疗法、疫苗和抗体等(表2)。

在34篇研究文献中，我们可以发现大多数的研究主要针对大学本科及以上的学生，而对于中小学的研究却很少。即使是大部分实验研究，实验对象也更多是对于大学本科生，如毕鹏晖（2017）针对大二学生的问卷和访谈得出结果研究大学英语微移动词汇学习融入形成性评估模式；李思萦、高原（2016）以4组非英语专业研究生为对象,通过测试考察了移动技术辅助外语教学与多模态结合对学习者词汇习得的影响；孔繁霞、王歆（2014）基于“投入量假设”理论,探讨了93名非英语专业二年级学生在阅读、听力、写作任务中的词汇附带习得效果等。

表1 冠状病毒SARS-CoV-2、SARS-CoV 和MERS-CoV 感染人及各种动物后的临床症状、病毒复制及组织病理变化Table 1 Clinical signs, viral replication and histopatholoical changes of SARS-CoV-2-, SARS-CoV- andMERS-CoV-infected humans and various animals

2.1 ZIKV 和 DENV 感染免疫缺陷小鼠模型

研究表明，Ⅰ型干扰素信号通路缺陷的小鼠对黄病毒的易感性增强[35]。Ⅰ型干扰素受体(interferon alpha receptor 1，IFNAR1)基因缺乏小鼠(如A129 小鼠)或干扰素调节因子(interferon regulatory factor，IRF)3、IRF5 和IRF7 三基因缺失小鼠在皮下注射、腹腔或静脉接种ZIKV 非洲株(MR 766 或Dakar 1984)、ZIKV 亚洲株(H/PF/2013)或ZIKV美洲株(Brazil Paraiba_2015)后均表现为严重病症，如后肢无力、瘫痪和死亡[36]。用阻断性抗I F N A R 1 单克隆抗体处理的野生型C57BL/6 小鼠，腹腔接种ZIKV Dakar 1984 后同样观察到类似的病症结果[37]。

相比于A129 小鼠，缺乏IFNAR1 和IFNAR2的小鼠(AG129小鼠)在感染ZIKV后表现出更大的易感性和更严重的疾病症状[38]。通过皮内、皮下或腹腔接种ZIKV 感染AG129 小鼠，结果表明所有的AG129 小鼠均表现出较严重的病症。研究发现，皮下接种仅1 个空斑形成单位的ZIKV 到3～4 周龄的AG129 小鼠，其致死率为100%[16]。AG129 小鼠感染ZIKV 后表现出包括颤抖、运动失调和瘫痪等严重症状，这与感染ZIKV的AG129小鼠发生中枢神经系统病变以及在大脑、脊髓、脾脏和睾丸等组织中具有高病毒载量有关[38]。

DENV和 ZIKV类似，同样也可感染A129 小鼠和AG129小鼠等。DENV感染AG129小鼠后，病毒复制水平较高，出现血小板减少、病毒血症和血浆渗漏等相应重症登革热临床症状，产生细胞因子风暴引起的免疫病理反应等[39]。因而，AG129 小鼠较常用于DENV研究。与AG129小鼠相比，A129小鼠感染DENV 可产生免疫受损相对较轻的症状，因此也可成功应用于相关研究[40]。

2.2 ZIKV 和 DENV 感染免疫健全小鼠模型

7～8 日龄的野生型C57BL/6 小鼠接种ZIKV Dakar 41519 或ZIKV H/PF/2013 后，小鼠出现中枢神经系统病症和部分致死现象[41]。而皮下接种ZIKV PRVABC59到1日龄的C57BL/6小鼠可导致非致命性神经疾病，表现为震颤、共济失调，并且持续到2 周后[42]。1 日龄的新生Swiss 小鼠通过皮下或颅内途径接种ZIKV SPH 2015，也表现出嗜睡、共济失调和瘫痪等症状，表明ZIKV 有感染大脑的迹象[43]。

DENV 可感染免疫健全野生型小鼠，如A/J、BALB/c和C57BL/6等品系，并出现暂时的病毒复制[44]。研究表明，DENV-2 病毒感染A/J 小鼠后第2 日，动物出现轻微的病毒血症，并可被RTPCR 方法检出[45]。DENV-2 病毒感染C57BL/6 小鼠后，外周血液中病毒含量呈峰状，感染后第1日病毒含量增加，第3 日达到高峰，第5 日出现下降趋势。DENV-2 病毒感染BALB/c 小鼠后，其血液中病毒效价相对较低，因此较难检出[46]。由此可见，DENV 在不同品系小鼠体内的复制水平有差异性。此外，小鼠年龄因素也会影响DENV的感染和复制，如DENV 颅内接种野生型乳鼠也可表现出外周病毒血症[47]。

2.3 ZIKV 和 DENV 感染非人灵长类动物模型

非人灵长类动物也被用来评估ZIKV 生物学和致病机制。用亚洲系ZIKV 株(H/FP/2013)感染猕猴，导致猕猴体质量轻度下降，注射部位周围出现轻度皮疹，部分动物血清肌酸激酶和丙氨酸转氨酶水平升高[48]。此外，ZIKV 感染的猕猴在感染后2～6 d 出现病毒感染高峰，但通常在第10 日就无法检测到[49]。通过多种研究方法，如ZIKV 基因组原位杂交、交叉反应的黄病毒特异性单克隆抗体免疫组织化学和RT-PCR 可检测分析待检组织中病毒R NA，结果表明，在猕猴和食蟹猴的多个组织中检测到有ZIKV 感染，包括次级淋巴器官、主要生殖道、肠、脑和脊髓[50]。另外该研究还发现，在一些个体的尿液、唾液和脑脊液中可检测到ZIKV RNA，在零星个体的阴道分泌物中也可检测到ZIKV RNA[50]。这些研究表明，猕猴和食蟹猴可作为模型用于ZIKV 感染细胞和组织倾向性等相关研究。

表2 寨卡病毒(ZIKV)和登革病毒(DENV)感染动物模型优缺点比较Table 2 Comparison of the advantages and disadvantages of ZIKV- and DENV-infected animal models

3 流感病毒感染动物模型

流感(influenza)是一种由流感病毒引发的急性呼吸道疾病。流感病毒属于正黏病毒科，拥有反义单链R N A 基因组，可分为甲型流感病毒(influenza virus A)、乙型流感病毒(influenza virus B)和丙型流感病毒(influenza virus C)3 种类型。甲型流感病毒包含8 个RNA 片段，分别编码聚合酶基础蛋白1、聚合酶基础蛋白2、血凝素(hemagglutinin, HA)、神经氨酸酶(neuraminidase,NA)、聚合酶酸性蛋白、病毒核蛋白、基质蛋白和非结构蛋白，可分为16 个HA 亚型和9 个NA亚型[51]。甲型流感病毒不仅在人类中传播，而且在家畜、家禽以及野生候鸟中均可传播[52]。乙型和丙型流感病毒没有被划分不同亚型，仅限于感染人类，没有已知动物宿主[53]。

禽流感病毒(avian influenza viruses，AIVs)属于甲型流感病毒属，可分为高致病性和低致病性两种亚型[54]。在AIVs 中，A/H7N9 病毒被认为是一种可能在人类中引起流感大流行的病毒株[55]。

流感动物模型在研究病毒致病性、疫苗研发、药物筛选和免疫反应等方面具有重要的科学意义。目前用于流感研究的动物模型主要包括雪貂、啮齿类动物、非人灵长类动物、猪、犬、猫和禽类等(表3)。

3.1 雪貂

20 世纪30 年代，雪貂就成为了第一个成功感染人流感病毒分离株的物种[56]，由于其对流感病毒具有易感性，而且其临床症状和传播动力学与人类非常相似[57]，所以是一种理想的流感病毒感染与传播模型。雪貂针对广泛的人类流感病毒分离株均具有易感性，如季节性H1N1[58]、大流行2009 H1N1[59]、H2N2[60]、H3N2[61]、H5N1[61]、H7 亚型[62]、H9N2[63]以及乙型流感病毒[64]。然而，雪貂作为流感模型尚存在动物获取难、畜牧设施复杂和免疫试剂缺乏等缺点[65]。

3.2 啮齿类动物模型

3.2.1 小鼠 人类流感病毒不能感染野生小鼠，只有在肺部进行传代适应后才能建立感染模型[66]。在小鼠中最常用的人类流感病毒之一是属于H1N1病毒的A/Puerto Rico/8/34 型(PR8)。需要适应株进行感染是小鼠模型的一个主要缺陷，因为传代会导致病毒基因突变[67]，突变可能导致病毒复制动力学改变，并使其获得逃逸免疫应答的能力[68]。另外，不同品系小鼠对适应株的敏感性有所不同，感染后很难观察到一些上呼吸道症状，与人类存在一定差异[69]。但小鼠仍然是研究流感病毒时使用最广泛的模型动物，因为其具有易获取、饲养成本低和免疫学试剂完备等优势。

3.2.2 豚鼠 虽然感染豚鼠所需的病毒量较大，但感染不需要传代适应的病毒株。而且与雪貂相比，豚鼠温顺，体型较小，入组数量更多。目前已经证明乙型流感病毒可以在豚鼠中很好传播，因此该模型成为了研究乙型流感病毒传播的唯一可用模型[70]。然而，豚鼠感染后不会出现临床体征，因此不是疫苗测试的理想模型[71]，但可以是研究疫苗影响传播的有效工具[72]。

表3 各类流感病毒感染动物模型优缺点Table 3 Comparison of the advantages and disadvantages of different animal models infected with influenza virus

3.2.3 大鼠和棉鼠 大鼠(F344和SD)接种鼠适应株H3N2 后，在肺泡灌洗液中可检测出炎性浸润和细胞因子，但病理改变较少[73]。棉鼠可感染非适应株人类流感病毒，病毒可在上下呼吸道复制，产生肺部病理学改变，这与人类自然感染时的情况相似[74]。

3.3 家猪

AIVs和人类流感病毒都可在自然条件下感染猪，所以猪被认为是流感病毒的中间宿主[75]。家猪可感染大多数的流感病毒亚型，对H5N1 具有易感性[76]。虽然感染后的家猪可能会出现体温异常升高和呼吸系统症状，但死亡率很低[77]。然而，家猪体型大，对饲养和实验空间的要求较高，因此很难成为一种理想的流感动物模型。

3.4 非人灵长类动物

非人灵长类动物可以自然感染流感病毒[78]，也可以成功感染许多流感分离株，包括季节性H1N1[79]、H3N2[80]、2009 大流行H1N1[81]、高致病性H5N1[82]和H7N9 病毒[83]。非人灵长类动物是理想的流感病毒感染模型动物，但不是理想的传播模型动物，因为在感染季节性流感病毒后，除高致病性的病毒株外，非人灵长类动物通常不会出现任何症状。而且由于伦理限制和成本高昂等问题，非人灵长类动物的使用受限。

3.5 猫和犬

猫和犬流感模型主要用于研究它们对H5N1的易感性，结果发现猫和犬可以作为哨兵或将病毒传播给人类[84]。但是猫和犬通常并不能很好地用于疾病和疫苗研究，所以应用不多。

3.6 禽类

禽类常用于评价AIVs 的致病性与传播性。鸭和水禽是AIVs 的主要宿主[85]。野鸭比其他野生鸟类更容易感染低致病性AIVs，且感染后无症状[86]。SPF 级鸡常用于AIVs 致病性评估与疫苗研发，而不同种类的鸭可用于病毒的地理分布研究[87-88]。

4 结语

本文对3 类常见且重要的新发RNA 病毒的现有动物模型进行了概述，并列表分析了它们各自的优缺点，这对于研究者选取合适的模型开展某种特定研究有一定借鉴意义。同时也要认识到，目前任何动物模型都有其局限性，针对任一种新发传染病的动物模型研究是一个不断深入进展的过程。可以相信，随着各种先进技术的发展与应用，未来必定会建立起更加能模拟人体实际情况、更加能适用于特定研究目的的新发传染病动物模型。