大肠杆菌O157:H7能力验证的结果与分析

刘秋婷 苏妙贞 陈丹霞 苏嘉妮 周 露

（广东省食品检验所 广东广州 510435）

1 前言

大肠杆菌O157:H7（简称O157:H7）是有周鞭毛且不产生芽孢的革兰氏阴性杆菌。1982年，O157:H7型肠出血性大肠杆菌食物中毒事件首次在美国发生，随后该菌引起的食物安全问题相继在德国、美国、加拿大、日本、中国等地区出现，受到全球民众的广泛关注[1-3]。人类食用O157:H7污染的食物后，最常见的症状是腹泻，严重者会引起出血性肠炎、血小板减少性紫癜、溶血性贫血等致死率高的食源性疾病[4，5]。 O157:H7在低温、强酸环境下容易存活，主要存在于牛肉、羊肉、猪肉、乳制品等食品中，可通过人与人接触和饮水进行传播。因此，我国将其列为21世纪可能对中国人群公共卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一[6，7]。GB 4789.36—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》[8]规定各种食品中不得检出O157:H7。

为了加强食源性致病菌的检测能力，提高实验室对O157:H7的检验鉴定水平，广东省食品检验所实验室在2019年11月参加了英国食品分析实验室质量评估体系（FAPAS）组织的能力验证活动，验证从牛肉中分离鉴定O157:H7的能力，为O157:H7的检测提供参考。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 样品

英国 FAPAS组织方提供了2份样品，样品编号为M247d11A和M247d11B。

2.1.2 培养基和试剂

缓冲蛋白胨水（BPW）；改良 EC肉汤（mEC+n）；改良山梨醇麦康凯琼脂（CT-SMAC）；月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-MUG（MUG-LST）；三糖铁琼脂（TSI）；营养琼脂；氧化酶试剂；革兰氏染色液；大肠埃希菌O157:H7生化鉴定盒（广东环凯微生物科技有限公司)；大肠杆菌O157免疫磁珠分离检测试剂盒（天津生物芯片技术有限公司）；CHRMAGAR O157显色培养基（法国科玛嘉公司）；革兰阴性细菌鉴定卡（GN卡）；VIDAS UP E.coli O157:H7试剂盒（法国梅里埃生物有限公司）；大肠埃希菌断血清 O157；大肠埃希菌诊断血清H7（宁波天润生物药业有限公司）。

2.1.3 标准菌株

大肠埃希菌 O157:H7（NCTC12900）；大肠埃希菌（ATCC25922）。

2.2 仪器

磁力架-样品混合器（Dynal）均质器（IUL）；生物安全柜（赛默飞世尔公司）；生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；显微镜（卡尔蔡司）；暗箱式四用紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）；VITEK 2compact全自动微生物快速检测分析系统 （法国梅里埃公司）；VIDAS 30全自动酶联免疫分析仪（法国梅里埃公司）。

2.3 方法

参照英国FAPAS实验室提供的O157:H7的作业指导书进行前处理和GB 4789.36—2016第二法免疫磁珠捕获法进行O157分离鉴定和生化血清鉴定，并借助VIDAS 30全自动酶联免疫分析系统进行初步快速筛选，同时以VITEK 2 compact全自动微生物快速检测分析系统进行生化鉴定，确保检验结果的准确性。

2.3.1 样品处理

实验开始前先对待测样品进行水化，在生物安全柜开启样品瓶盖，样品M247d11A和M247d11B中各添加20 mL BPW进行水化并轻轻翻转样品瓶几次以充分混匀，将样品在室温下放置28～30 min，即可测试。

2.3.2 增菌

以无菌操作将2份样品分别加入225 mL改良EC肉汤中，用均质器连续拍打1～2 min，在36℃条件下培养24 h。同时取阳性对照菌NCTC12900大肠埃希菌O157:H7和阴性对照菌ATCC25922大肠埃希菌于225 mL改良EC肉汤中，在36℃条件下培养24 h，后续同步进行选择性分离与生化鉴定实验。

2.3.3 免疫磁珠捕获与分离

将1.5 mL灭菌离心管按样品和质控菌株进行编号，在管中加入20 μL免疫磁珠，然后加入1 mL样品增菌液，振荡混匀后将离心管夹在混合器上，以12 r/min转速旋转混合10 min。取下离心管，放在磁力架的孔中，静置3 min，磁珠被吸附在管壁上形成棕色聚集物，轻轻吸走管中上清液。加入1 mL洗脱缓冲液重悬磁珠，将离心管颠倒混合5～8次，再置于磁力架中，静置3 min，吸走多余液体。重复洗涤一次，最后加入50 μL洗脱缓冲液重悬磁珠。各吸取25 μL免疫磁珠悬液至CT-SMAC平板和改良O157显色琼脂平板一侧，然后用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半，再用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂表面水分完全吸收后，翻转平板，在36℃±1℃条件下培养24 h，观察2种平板上的菌落特征。

2.3.4 VIDAS 30全自动酶联免疫分析系统检测

依据VIDAS UP E.coli O157:H7试剂盒说明书，取1 mL增菌后的改良EC肉汤，在100℃水浴中煮沸10 min。冷却至室温后，取0.5 mL增菌液至VIDAS大肠埃希菌O157试剂条的样品孔中，按仪器操作规程进行检测。

2.3.5 生化实验

挑取2.3.3得到的大肠埃希菌O157:H7可疑菌落接种于营养琼脂平板上进行纯化，36℃培养24 h，进行生化鉴定和VITEK 2 Compact鉴定实验。

2.3.6 血清学实验

对符合生化鉴定和VITEK 2 Compact鉴定结果的菌株进行血清学鉴定。采用玻片凝集试验，在洁净玻片上2个不同区域各滴1滴O157血清和H7血清，在另一干净玻片加入1滴生理盐水做对照，用接种环挑取菌落分别与血清和生理盐水研磨混匀，轻轻摇动玻片1min，对照黑背景观察有无凝集现象。1min内呈明显凝集者为阳性，呈均匀浑浊者为阴性。

3 结果与分析

3.1 免疫磁珠捕获与分离结果

样品M247d11A、M247d11B、阳性对照大肠埃希菌O157:H7、阴性对照大肠埃希菌经过免疫磁珠富集和平板划线分离后，结果详见表1。

3.2 VIDAS 30全自动酶联免疫分析系统检测和VITEK鉴定结果

使用VIDAS UP E.coli O157:H7试剂盒检测后，样品M247d11A为O157:H7阳性，样品M247d11B为O157:H7阴性。VITEK检测结果显示，样品M247d11A检出O157:H7，样品M247d11B未检出，两者的鉴定结果一致，详见表2。

表1 免疫磁珠捕获与分离结果

表2 VIDAS 30全自动酶联免疫分析系统检测和VITEK鉴定结果

3.3 生化鉴定结果

按照国家标准GB 4789.36—2016进行鉴定，可以判断M247d11A检出O157:H7，M247d11B未检出O157:H7，详见表 3。

表3 生化鉴定结果

3.4 血清学试验结果

将M247d11A和M247d11B上的可疑菌落进行纯化培养后，按照国家标准GB 4789.36—2016第二法中血清学试验要求用O157和H7诊断血清做玻片凝集试验，详见表4。

表4 血清学试验结果

4 结论

本次能力验证实验先用BPW肉汤进行水化，再加入改良EC肉汤进行前增菌，这样可以激活样品中目标菌的生物学特性[9]，避免出现假阴性，对实验结果造成影响。由于O157:H7编码的β-葡萄糖醛酸酶无活性，不能分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷产生荧光，样品M247d11A观察到的MUGLST为无荧光现象，结果表现为阴性，这对区分各种大肠杆菌具有重要作用。O157在显色培养基上呈现淡紫色，而其他杆菌呈现无色或被抑制，其抗干扰能力和特异性均比较强，在24 h内即可观察菌落形态，减少产生假阳性菌的机率[10]。而在CT-SMAC平板中，由于O157:H7不发酵或迟缓发酵山梨醇，故在平板上为圆形，无色，中心呈现灰褐色的菌落。日常检验中可以根据O157:H7的这几个主要生物学特征，初步判定可疑菌，再结合后续生化实验，更好地作出判断。

免疫磁珠捕获法是利用磁珠表面的O157特异性抗体来捕获样品中的表面抗原，磁珠在磁场作用下，被吸附沉淀，与样品中的其他物质快速分离，从而达到分离O157:H7的目的[11]。实验增菌后，先利用免疫磁珠进行捕获，再结合选择性分离培养，这样可以减少样品残渣和其他大肠杆菌属等杂菌的干扰，从而达到在成分复杂的食品中富集到目标菌的目的[12]。该方法与常规检验方法相比，能准确、迅速地分离样品中的目标菌，但也存在影响检测结果的因素，如样品存在其他杂菌的污染、磁珠表面抗体的特异性、磁珠捕获时间长短等，而且其价格较高，不能被广泛运用到量大的检测工作中。

在2种快速鉴定方法中，VIDAS 30能快速筛选出待测增菌液中的目标菌，减少检测时间，提高效率，但也会有漏检的情况出现，所以得出阳性结果后还要做进一步的验证实验。VITEK 2 Compact能对分离出的可疑菌落进行比较准确的生化鉴定，但可疑菌落的选择和菌液的纯度对该方法有一定的影响。因此，在检测工作中，可在国标法的基础上将VIDAS 30和VITEK 2 Compact相结合，快速筛查出目标菌，再按传统细菌生化试验和血清学进行下一步验证，使结果更加准确可靠。免疫磁珠分离技术具有强特异性、高敏感性以及快速筛选等特点[13]，目前，该方法可与PCR（多聚酶链式反应）技术[14]、胶体金免疫层析技术[15]、红外光谱技术[16]等各种高灵敏检测方法结合，对O157:H7进行分离鉴定，高效完成检测任务，提高食源性致病菌的检出率。

能力验证是利用实验室间的比对，按照预先制定的准则对参加者的能力进行评价，是一种有效的外部质量控制手段[17]。参加O157:H7国际性能力验证，不仅可以验证实验室自身的检验能力，也可以提升实验室在食源性致病菌方面的检测技术水平，对完善实验室管理体系文件起到积极作用。通过验证能够了解技术上的不足及存在的问题，采取正确的改进措施，更好地完成今后的检测工作。