新疆汉、维、哈三民族人群酒精依赖者糖缺陷转铁蛋白含量的测定与差异分析

黄培培 艾克拜尔·热合曼 米尔孜合买提·买买提明 阿尔孜古丽·木塔力甫 谢 辉＊

（1、齐鲁医药学院机能学实验中心，山东 淄博255000 2、宁德师范学院化学与材料学院，福建 宁德352100 3、乌鲁木齐市第四人民医院戒酒科，新疆 乌鲁木齐830000 4、新疆维吾尔自治区人民医院临床检验中心，新疆 乌鲁木齐830001 5、新疆医科大学法医学教研室，新疆 乌鲁木齐830011）

酒精滥用严重危害个人健康，长期饮酒会引起慢性肝脏损害和精神认知障碍及其它身体障碍，同时产生酒精依赖，导致个人和社会公共安全问题[1]。在酒精依赖患者的治疗监测和司法鉴定中，需要新的可靠的、准确的生化指标物，这对个体健康和社会安全具有重要意义。然而，众所周知，酒精饮用传统的生化指标物如丙氨酸转氨酶（ALT）、天门冬氨酸转氨酶（AST）、谷胺酰转肽酶（GGT）和平均红细胞体积（MCV）[2]，均缺乏敏感度和特异性。所以，迫切需要用于早期检测酒精摄入过多的新的标志物。

CDT 是无唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白和二唾液酸转铁蛋白的总和[3，4]，其中二唾液酸转铁蛋白含量最多。研究表明，糖缺陷转铁蛋白（CDT）水平与酒精饮用度有密切的关系。饮酒会增加血清CDT 含量，尤其是无唾液酸和二唾液转铁蛋白[4]，每天饮酒60-80g 持续至少10-15 天时，该值明显升高，而戒酒治疗2 周或3 周时，则CDT 值恢复到正常水平。自1976 年[3]被首次发现后，CDT 已经迅速成为基础和临床研究中用于检测重度酒精的焦点[3，4]。

最近二十年，一个基于Sebia（Every，France）分析原理的完全自动的毛细管区带电泳法（CZE）技术迅速发展起来[3-7]。CZE可以检测所有转铁蛋白及其基因变异体。有研究证实检测CDT的毛细管电泳法目前已拥有了良好的精密度、可靠的线性范围[3，4]。这篇文章，我们将测试新疆未饮酒健康者、偶尔饮酒者、酒精依赖者的CDT 含量并进行差异分析，为酒精依赖临床诊断、治疗监测和司法鉴定提供科学检测数据和参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

毛 细 管 区 带 电 泳Capillarys （Sebia， 法 国）。 冰 箱（FCD-217SE，海尔电冰柜）。低速大容量离心机（TDL-50B，上海安亭科学仪器厂）。罗氏cobas c311 全自动生化分析仪（Mannheim，德国），贝克曼库尔特LH750 血细胞分析仪（Coulter，美国）。Capillarys CDT 试剂盒（Sebia 公司）：CDT 正常质控品（批号：23022/01）和高值质控品（批号：07062/01）、碱性缓冲液（批号：07055/80）、样品稀释液（批号：26055/01）、洗液（批号：01065/80）和CDT 洗液（批号：06015/01）；质控条形码、稀释小杯、滤器、CDT 清洗杯。一次性使用真空贮血管（赣达医疗器械有限公司）。

1.2 研究对象及分组

新疆乌鲁木齐市第四人民医院戒酒科提供汉族、维吾尔族、哈萨克酒精依赖患者血样141 份和汉族、维吾尔族、哈萨克偶尔饮酒者血样154 份，新疆医科大学附属医院检验科提供73份未饮酒健康人血样。共368 份血样。研究对象分成三组：未饮酒健康人组（23 个汉族人、21 个维吾尔族人、29 个哈萨克族人）、偶尔饮酒者组（57 个汉族人、65 个维吾尔族人、32 个哈萨克族人）和酒精依赖者组（72 个汉族人、31 个维吾尔人、38 个哈萨克族人）。新疆医科大学第一附属医院伦理委员会允许进此项研究。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

护士在清早人员空腹时收集静脉血样于不含抗凝剂的真空采血管中。样品取回后，用离心机（TDL-50B）3000r/min 离心5分钟。离心后，取上清液保存于-20℃冰箱中，直至测量。

1.3.2 毛细管区带电泳检测CDT 含量

毛细管电泳仪配备有8 个毛细管，17.5cm×25mm。毛细管电泳仪可以同时检测7 个样品，其中8 号位置放样品稀释液。毛细管电泳法依据不同转铁蛋白亚型电荷差异进行区分，可提供可见的转铁蛋白亚型条带，并对不同亚型分别进行定量，毛细管电泳法是在200 nm 处检测肽键的紫外（UV）吸收峰[3，5]。二唾液酸转铁蛋白等电点PI 为5.7，无唾液酸转铁蛋白PI 为5.9，单唾液酸转铁蛋白PI 为5.8[8，9，10]。在毛细管区带电泳系统中（Sebia，France），带电分子在具有一定pH 的碱性缓冲液中根据电解液的pH 和电渗流的不同，而迁移分离开。CDT 值以无唾液酸转铁蛋白和二唾液酸转铁蛋白峰面积之和（A0+A2）占无唾液酸转铁蛋白到五唾液酸转铁蛋白峰面积之和（A0+A2+A3+A4+A5）的 百 分 比 形 式 表 达[11]，即CDT=（A0+A2）/（A0+A2+A3+A4+A5）×100%。毛细管电泳法主要将各亚型分离后再进行吸光度检测，依据峰面积来计算出CDT 与转铁蛋白总量的百分比[3，5，12]。所有操作根据制作商提供的说明书的操作步骤完成。根据制作商的指令，CDT 值＞1.6%为阳性，1.3%＜CDT 值≤1.6%需要再次检查，CDT≤1.3 为阴性[11]。电泳分析使用软件CAPILLARYS release 6.1.2 完成。

1.3.3 精密度实验

准备低、中、高浓度的CDT 血清样品，每种浓度的样品分别连续进样5 次，按1.3.2 毛细管电泳条件进行检测，测得CDT值，其RSD 值为1.245 0%～5.826 8%。见表1。

表1 毛细管电泳仪测量糖缺陷转铁蛋白的精密度

1.4 统计学方法

应用SPSS21.0 统计软件进行统计学分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 汉、维、哈三民族健康未饮酒者和酒精依赖者CDT 含量

CDT 包括无唾液酸转铁蛋白和二唾液酸转铁蛋白。正常人，CDT 含量极少，主要是二唾液酸转铁蛋白，几乎不含无唾液酸转铁蛋白或单唾液酸转铁蛋白[3，5]，如表2、图1。饮酒后，尤其是酒精依赖者体内转铁蛋白所含的唾液酸分子减少，使二唾液酸转铁蛋白、无唾液酸转铁蛋白的转铁蛋白亚型水平升高[4]。酒精依赖者体内的二唾液酸转铁蛋白含量明显增加[13]，且出现无唾液酸转铁蛋白，如表3、图2。无唾液酸转铁蛋白、二唾液酸转铁蛋白、三唾液酸转铁蛋白、四唾液酸转铁蛋白、五唾液酸转铁蛋白在图表中分别使用0-sialo、2-sialo、3-sialo、4-sialo、5-sialo来表示。表2、表3 中各唾液酸值均以其占所有唾液酸百分含量来表示。

表2 CZE 法健康未饮酒者血清CDT 检测结果值

图1 未饮酒者血清CDT 毛细管电泳检测图

表3 CZE 法酒精依赖者血清CDT 检测结果值

图2 酒精依赖者血清CDT 毛细管电泳检测图

2.2 新疆三个民族健康未饮酒者组、偶尔饮酒者组、酒精依赖者组CDT 含量差异分析

表4 新疆汉、维、哈三个民族未饮酒者组、偶尔饮酒者组、酒精依赖者组CDT 水平的比较

健康未饮酒者、偶尔饮酒者和酒精依赖者三组之间的CDT含量差异有统计学意义（P＜0.001），见表4。健康未饮酒组与偶尔饮酒者组之间的CDT 水平差异没有统计学意义（P＞0.05），健康未饮酒者组与酒精依赖者组间的CDT 水平差异有统计学意义（P＜0.001）,偶尔饮酒者组与酒精依赖者组间的CDT 水平差异有统计学意义（P＜0.001），见表6。

各民族受试正常健康人群CDT 含量之间的差异无统计学意义（P＞0.05），各民族偶尔饮酒人员CDT 含量之间的差异无统计学意义（P＞0.05），酒精依赖者组汉、维、哈三民族间的CDT水平差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。汉族与维吾尔族之间CDT 水平差异有统计学意义（P＜0.05），汉族与哈萨克族之间CDT 水平差异有统计学意义（P＜0.05），维吾尔族与哈萨克族之间CDT 水平差异没有统计学意义（P＞0.05），如表5。

表5 酒精依赖者组CDT 的两两比较结果

2.3 转铁蛋白遗传变异的频率

在368 个新疆人的血清CDT 中，15 个血清样品有转铁蛋白的遗传变异（B 型或D 型），变异率为4.07%。毛细管电泳变异图如图3，2-sialo=0.6%，变异体97.9%，变异体1.5%。

图3 血清CDT 毛细管电泳遗传变异图

3 讨论

毛细管电泳法由于其固有的高选择性、易操作、高生产率、自动化、省时省力等特点，被临床优选确认使用。本文选择此方法检测新疆汉族、维吾尔族、哈萨克族未饮酒健康人、偶尔饮酒者和酒精依赖者血清中CDT 的含量。结果显示汉、维、哈三个民族中酒精依赖人群血清CDT 水平之间具有统计学差异（P＜0.05）。CDT 是一个灵敏度、特异性最佳的标记物，将作为司法鉴定酒精依赖的标记物。

表6 未饮酒健康人组、偶尔饮酒者组、酒精依赖者组CDT 两两比较结果

人转铁蛋白的38 个遗传变异会引起氨基酸替换[3，5]。常见的等位基因型是阳极B 型和阴极D 型等位基因。D 型-转铁蛋白可以引起非滥用者的假阳性结果，B 型-转铁蛋白可以引起慢性酒精滥用的假阴性结果。CZE 可以检测所有转铁蛋白及其基因变异体，避免不准确的CDT 测量。据报道，白种人的遗传变异率是低的（＜1%），而非洲裔美国人、非洲黑人和美国南部土著人的遗传变异率是高的[3，5]。本文研究结果显示新疆人转铁蛋白变异的频率是4.07%，这比Hee-Won Moon[5]和Binbin Song[3]的研究变异率稍低。Hee-Won Moon[5]研究显示在韩国人中，变异率为4.1%。Binbin Song[3]研究显示在中国汉族人中，变异率为4.14%。

尽管有大量研究试图解释饮酒为何能使转铁蛋白中的唾液酸含量减少，但是目前具体机制仍不明确[4]，确定其中并不是一个简单的过程，而是由多种酶类参与、多步骤的过程[15]。在健康的对照组中尚未发现无唾液酸转铁蛋白和单唾液酸转铁蛋白。这证实了酒精滥用会引起转铁蛋白的唾液酸缺失，这可能是由于糖基转移酶改变，特别是唾液酸转移酶。

本次研究，不能准确地评估饮酒习惯，因为我们的评估是基于回顾性研究。然而，长期饮酒的前瞻性实验可能会发生伦理问题，这对进一步研究造成一定困难。另外，部分研究对持续饮用量定义不明，比如有关文献报道在持续酒精饮用（50-80g/d）中至少一周后血CDT 的浓度增加[5]，而另一份报道却显示酒精饮用（60g/d）至少两周后CDT 浓度增加[14]，戒断期间，CDT 值慢慢恢复正常。尽管在CDT 水平和慢性酒精饮用间有一个清晰的关系，但如何用CDT 值来诊断酒精滥用程度尚未清楚，迫切需要更多的研究来解决这个问题。