蒙古族人MicroRNA-149 和196a2 单核苷酸多态性肝细胞癌易感性

徐海霞，李心红

（内蒙古医科大学附属医院放疗科，内蒙古呼和浩特 010060）

肝细胞癌（hepatocellular cancer，HCC） 是目前全球第二大癌症死亡原因。在肝细胞癌患者中，约50%与肝炎有关肝细胞癌（HCC） 目前是全球第二大癌症死亡原因[1-2]。MiRNA 为19-24nt 短核苷酸序列，可与多个靶序列互补结合。单核苷酸多态性（SNPs） 是遗传多态性的常见变异，被认为是预测癌症风险的潜在生物标志物[3-5]。如果miRNA基因发生变异，可能会影响成熟miRNA 的质量和数量，甚至影响到被改变的miRNA 调控的数百个靶基因。因此，miRNA 单核苷酸多态性由pri-miRNA 单核苷酸多态性和pre-miRNA 单核苷酸多态性组成，分别位于miRNA 基因500～3 000 bp 和60～70 bp 区域[6]。

到目前为止，已有报道认为miRNA 单核苷酸与胃癌、食管癌、乳腺癌和神经母细胞瘤等多种肿瘤相关[7]。本研究对蒙古族人肝细胞癌发展中的miR-196a2 rs2910164，miR-149 rs2292832 的多态性进行了分析，以期望能够对于肝细胞癌的预防及诊断提供可靠的参考依据。

1 资料与方法

1.1 材料

主要试剂：血液DNA 提取试剂盒购自天根生物公司。PCR 试剂盒购自全式金生物公司。

1.2 研究对象

蒙古族肝癌患者均来自于内蒙古医科大学属医院2018年10月至2019年12月。各个盟市来内蒙古医科大学附属医院的蒙古族80例肝细胞癌患者和蒙古族60例对照受试者是在我医院进行体检后随机选择。每一名受试者均签署书面知情同意书。所有工作均在护士的帮助下完成。

1.3 方法

1.3.1 血液DNA 的提取DNA 的提取按试剂盒说明书操作。简单来说就是，取200 μL 的血液，加入200 μL的缓冲液肯20 μL的蛋白酶K，56℃消化10 min，期间混匀数次，直至溶液变清亮。室温静置3 min 然后加入350 μL的BD 缓冲液，混匀，倒入吸附柱CG2 中，13 400 g 离心30s，倒掉收集管中的液体。再加入500 μL的缓冲液GDB，13 400 g离心30 s 倒掉收集管中的液体。加入600 μL的漂洗液，13 400 g 离心30 s 倒掉收集管中的液体，重复此步骤，然后加入100 μL的洗脱液，13 400 g 离心2 min，收集液体保存。

1.2.2 基因检测引物序列（表1）：所有引物由上海生工程合成。

表2 酶切位点Tab.2 Restriction sites

然后进行PCR 反应。PCR 反应过程为，95℃5 min，（95 ℃30 s，56 ℃30 s，72℃30 s） 35个循环，72 ℃40 min，4℃保存。

1.2.3 基因分析根据不同酶切位点进行酶切分析，所有酶切均在37℃下进行。酶切后进行电泳。

1.3 统计学处理

所有统计分析均由SPSS 软件完成。绝对变量表示为频率和百分比。分别通过双尾studentt检验和χ2检验对连续变量与绝对变量间的不同进行分析。显著水平为P＜0.05。

2 结果

SNP 位点均采用PCR 产物酶切，依据电泳图可得到（图1） miR-196a2 rs11614913，CC 为202 bp，CT 为202 bp+50 bp，TT 为50 bp。miR-149 rs2292832，CC 为135bp，CT 为135 bp+40 bp，TT为40 bp。

本研究的肝细胞癌患者和对照受试者登记录入。肝细胞癌和对照受试者年龄、性别吻合度的P值（0.66 和1.00） 均大于0.05。

对 照 组 miR-196a2 rs11614913，miR-149 rs2292832 的基因型分布符合哈迪-温伯格平衡定律，人口的抽样合格。miR-196a2 rs11614913 的TT 基因型和T 等位基因与CC 基因型相比，肝细胞癌危险性分别增加了2.26 倍和1.50 倍，见表3。

miR-196a2 rs11614913 的多态性和肝细胞癌危险性之间的关系没有受到年龄、性别，饮酒与否，居住地区，肿瘤大小等影响，见表4。

图1 miR-196a 和miR-149SNP 酶切电泳图Fig.1 miR-196a and miR-149SNP digestion electrophoresis

表3 miR-146a rs2910164,miR-149 rs2292832 多态性与肝细胞癌危险性之间的关系Fig.3 The relationship between miR-146a rs2910164,miR-149 rs2292832 polymorphism and the risk of hepatocellular carcinoma

表4 人口统计及临床特征Tab.4 Demographics and clinical characteristics

3 讨论

肝癌是世界上第二常见的恶性肿瘤，据估计每年有782 500例新发病例和745 500例死亡病例报告，其中50%以上来自中国[2，8]。miRNA 在真核生物中保存良好，被认为是基因调控的重要组成部分[9-11]。新的研究表明miRNA 参与了多种生物学过程，包括发育、分化、细胞生长和凋亡[10，12]。本研究发现肝细胞癌危险性增加与miR-196a2 rs11614913 的TT 基因型和T 等位基因有明显的相关性[7，13]。有报道称，肝癌患者中miR-196a2（rs11614913） 基因型的频率有显著差异[6]。据报道，miR-196a2 基因型分布与正常对照组相比有显著性差异（C ＞T）；发现miR-196a2cc 基因型和C等位基因在中国人肝癌发病中有重要作用，尤其是在 HBV 感染患者中研究表明 miR-196a2 rs11614913 的多态性可以作为肝细胞癌的诊断标记[8，14-16]。有 较 多 研 究 发 现miR-196a2 rs11614913的多态性与几种癌症，如胃癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌和肾癌的危险性显著相关，但是结果不太一致[3]。miR-196a2 rs11614913 的多态性与胃癌危险性不相关。有研究发现，miR-196a2 rs11614913 影响肺癌的易感性[6]。在印度人中做了研究，多元统计分析显示miR-196a2 rs11614913 的多态性使绝经后的妇女乳腺癌危险性增加了3.2 倍[4]。本研究为临床诊断蒙古族肝癌的诊断奠定基础。