血清miR-711、miR-203对阿尔茨海默病的诊断效能评估

于 明 钱胜男 徐宇浩 孟 洁

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是老年人发生痴呆的首要病因，给家庭和社会带来了严重的负担[1]。轻度认知障碍(mild cognitive impairment，MCI)是未发展到痴呆的过渡阶段[2]。其中，以记忆损害为主要表现的遗忘型轻度认知功能障碍(amnestic mild cognitive impairment，aMCI)是结局易发展为AD源性痴呆或AD痴呆(AD-dementia，ADD)的高风险MCI类型，可认为是AD病程发展的早期阶段[3]。因此对aMCI和AD患者进行早期识别和干预至关重要。然而，AD和aMCI作为以认知功能障碍为主要表现的疾病，其诊断过程中过度依赖量表评分，主观性较强，现仍缺乏高效便捷的客观指标应用于诊断。目前血清miRNA以简单、无创、迅速等优点广泛应用于多种疾病的诊断和监测。已有诸多研究显示miRNAs在神经系统发育和高级脑功能的生理中起着重要作用，并参与了神经变性疾病的病理机制[4～6]。miR-711和miR-203作为参与神经细胞凋亡的两个关键分子，已有研究应用于脑损伤的诊疗，然而在AD患者中的应用尚未见报道[7,8]。本研究通过检测aMCI及ADD患者血清中miR-711和miR-203的表达，评价两者对aMCI、ADD诊断价值。

资料与方法

1.一般资料收集：采用病例对照研究，收集18例健康志愿者作为正常对照组(NC)，并选取2018年11月～2019年5月在江苏大学附属医院神经内科就诊的18例aMCI、18例ADD患者作为研究对象。所有研究对象均由专业的神经内科医生进行临床诊断及认知功能评估，并行血液学检查排除肝脏、肾功能障碍、甲状腺、血清梅毒和HIV抗体及肿瘤标志物阳性的受试者。所有受试者均签署知情同意书。本研究经江苏大学附属医院医学伦理学委员会审查批准。

2.纳入标准：aMCI组纳入标准：①根据国际工作组在2003年提出的MCI诊断及分类标准[9]和Petersen提出的aMCI诊断标准[10]：可通过患者的病史资料、知情人讲述或临床医生观察发现的以记忆力减退为主诉的认知功能障碍，其他认知领域保持相对完整；记忆损害超出了患者年龄和教育背景的正常功能范围，但不足以诊断为痴呆；日常生活能力不受影响；②临床痴呆评定量表(CDR)评分0.5分；③头颅CT/MR除外脑血管病、占位及其他异常信号。ADD组纳入标准：①2011年美国神经病学、语言障碍和卒中研究所-AD及相关疾病协会(NINCDS-ADRDA) 提出的诊断标准中的“很可能的AD痴呆”[11]；②排除帕金森、路易体痴呆等其他原因所致的痴呆；③CDR评分≥1分；④头颅CT/MR有双侧颞叶内侧萎缩的证据，支持AD的诊断，且除外脑血管病、占位及其他异常信号。NC组纳入标准：①年龄和性别与病例组完全匹配；②日常生活功能良好；③CDR评分0分，认知功能正常；④直系亲属中无痴呆患者；⑤头颅CT/MR及神经系统检查无异常。

3.排除标准：严重精神疾病、肿瘤、风湿免疫性疾病、血液系统疾病、严重的肝脏、肾功能不全、其他神经系统疾病、脑器质性疾病和颅脑外伤等。

4.血清样本收集：所有研究对象均在清晨空腹状态下使用促凝管采集4～5ml静脉血，置于4℃冰箱保存2h后，于4℃离心机以3000r/min离心10min，收集上清液进行miR-711和miR-203表达水平测定。

5.引物设计及合成：采用茎环法进行引物合成，所有引物均由上海生物工程技术有限公司设计合成。荧光定量PCR引物序列如下：miR-711：上游引物5′-CGGGGACCCAGGAGA-3′；下游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。miR-203b-5p：上游引物5′-GCGCGTAGTGGTCCTAAACAT-3′；下游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。

6.RNA提取及定量检测：首先参照miRNA提取试剂盒的指示，提取血清中总miRNA，并使用分光光度仪检测RNA浓度和纯度；然后用HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit(by stem-loop)对RNA进行反转录反应；继之进行荧光定量PCR反应：按照UltraSYBR Mixture(Low ROX)试剂盒说明配置50μl的反应体系，以U6作为内参基因，按照三步法反应程序进行PCR反应，预变性(95℃ 10min)、变性(95℃ 10s)、退火(58℃ 30s)、延伸(72℃ 32s)，共35个循环；最后用溶解曲线(95℃ 15s、60℃ 1min、95℃ 15s、 60℃ 15s)检测特异性。按照2-ΔΔCt算法计算相对定量表达分析。

7.神经心理学测试：由神经科医生采用MoCA和CDR量表对所有受试者在安静环境中进行认知功能评估。

结 果

1.3组受试者临床资料比较：3组在年龄、性别、受教育年限方面比较，差异无统计学意义(P>0.05，表1)，具有可比性；3组危险因素比较差异无统计学意义(P>0.05)。3组CDR和MoCA评分两两比较差异均有统计学意义(P<0.01)。与NC组比较，aMCI组和AD组的MoCA评分均降低，而CDR评分均升高。

表1 3组受检者的一般资料

2.3组血清miR-711和miR-203相对表达量的比较：3组间miR-711和miR-203相对表达量差异有统计学意义(F=12.28，P=0.000；F=12.20，P=0.000)。事后分析发现,与NC组比较，aMCI和ADD组血清miR-711表达均增加(P<0.01、P=0.000)，且在ADD组中表达增加更明显；aMCI和ADD组血清miR-711表达比较差异无统计学意义(P>0.05，图1)。与NC组比较，ADD组血清miR-203表达增加(P=0.000)、aMCI组血清miR-203表达差异无统计学意义(P>0.05)；ADD组血清miR-203表达较aMCI组增加更加明显(P<0.01，图2)。

图1 血清中miR-711在3组中的相对表达水平*P<0.01，**P=0.000

图2 血清中miR-203在3组中的相对表达水平*P<0.01,**P=0.000

3.血清miR-711和miR-203相对表达量与认知功能的关系：Spearman相关性分析表明，血清miR-711和miR-203相对表达量与MoCA评分呈负相关(r=-0.52，P=0.000；r=-0.49，P=0.000，图3)。

图3 miR-711、miR-203与MoCA评分的相关性

4.血清miR-711和miR-203对aMCI诊断价值的ROC分析：应用ROC曲线评价血清 miR-711用于诊断aMCI时，曲线下面积(AUC)为0.812(95%CI：0.669～0.954，P<0.01，图4)，具有一定的诊断价值；其诊断临界值为 1.626 时，特异性为72.2%，敏感度为88.9%。血清 miR-203用于鉴别aMCI及ADD时，AUC为0.718(95%CI：0.551～0.884，P<0.05，图5)，具有一定的鉴别诊断价值；其诊断临界值为1.965时，特异性为72.2%，敏感度为61.1%。

图4 miR-711对诊断遗忘型轻度认知障碍的ROC曲线

图5 miR-203对鉴别遗忘型轻度认知障碍和ADD的ROC曲线

5.血清miR-711和miR-203对ADD诊断价值的ROC分析：单独检测血清中miR-711和miR-203表达水平对ADD患者的诊断有很高的价值，且两者联合诊断价值更高(P=0.000，图6)。检测血清 miR-711水平用于诊断ADD时，AUC为0.875(95%CI：0.763～0.987，P<0.01)，具有一定诊断价值；其诊断临界值为 0.536 时，特异性为 88.9%，敏感度为77.8%。检测血清miR-203水平用于诊断 ADD时，AUC为0.889(95%CI：0.776～1.000，P<0.01)，诊断价值较高；其诊断临界值为0.715时，特异性为100%，敏感度为66.7%。运用Logistic回归模型构建血清miR-711和miR-203联合诊断的ROC曲线分析显示，AUC为 0.948(95%CI：0.871～1.000，P=0.000)；当诊断临界值为0.46时，特异性为94.4%，敏感度为94.4%。

图6 血清miR-711、miR-203对ADD单独及联合诊断的ROC曲线

讨 论

AD是隐匿起病、进行性发展的神经退行性疾病，因高发生率和巨大的社会经济负担成为亟待解决的问题。近10余年来对AD的发展过程已有了深入了解，目前国际公认的AD的3个阶段包括无症状持续发展的临床前阶段、AD源性的MCI阶段以及终末的AD痴呆阶段。aMCI作为广义的MCI中常见的类型，较其他MCI更易向ADD转化，认为是ADD的临床高危阶段[12]。目前认知障碍性疾病的诊断和鉴别以临床症状、神经心理学量表、神经影像学为主，NIA-AA也提出了脑脊液Aβ42和tau蛋白等生物学标志物，但都有一定的局限性[10]。作为可早期识别和诊断认知障碍性疾病的非侵入性、廉价、高效的生物学标志物，血清miRNA成为目前痴呆领域研究的热点[13]。

研究发现，miR-34a-5p和 miR-545-3p在AD患者血清中表达水平明显高于MCI和NC组，可作为早期诊断AD的标志物[14]。Hill等[15]研究发现AD患者外周血中miR-29、miR-107、miR-181及miR-146存在着差异性表达，可能参与了AD的发病机制，但目前尚无达成一致的高特异性的血清诊断标志物。相关研究发现认知障碍疾病的发病机制与多种因素相关，包括神经细胞凋亡、氧化应激、线粒体及突触损伤等，miR-711和miR-203曾证明可作为创伤性脑损伤的潜在生物学标志物，但在认知障碍疾病中尚无研究，检测两者在血清中的表达水平可能为aMCI和ADD的诊断提供一定的应用价值[16]。

本研究发现，aMCI和ADD组中血清miR-711表达均较NC组增加，以ADD组增加更明显；但aMCI和ADD组的血清miR-711表达差异无统计学意义。相关性分析表明，miR-711表达水平与MoCA评分呈负相关，可见miR-711可作为评估认知功能障碍程度的指标。另外，ROC曲线分析显示，miR-711对ADD及aMCI的诊断具有一定的应用价值。在AD的临床前阶段，虽然患者未出现明显的认知功能改变或仅有轻微受损，但是体内的病理学改变已经出现[17]。随着认知功能受损的加重，病理标志物的变化可能更加显著，更易被检出。本研究表明，虽然aMCI患者认知功能减退不明显，但miR-711在体内的表达量已发生改变，故可将miR-711作为aMCI初筛标志物。已有研究发现，在控制性脑皮质撞击模型中，小鼠脑损伤后3h就可检测到海马中miR-711表达水平上调；而海马与认知功能密切相关，推测本研究中血清miR-711的早期改变可能与海马早期受损机制相关。另外，通过KEGG等通路分析以及靶向因子等实验证实，miR-711可靶向抑制AKT诱导神经细胞凋亡，同时也参与氧化应激通路，这可能与认知障碍性疾病的机制相关[7]。

本研究还发现，ADD组血清miR-203表达较NC组及aMCI组均增高，但aMCI组血清miR-203表达与NC组比较差异无统计学意义。因此，miR-203虽然不能发现早期的认知功能障碍，但监测血清miR-203的表达水平可能能够反映认知障碍的损害程度。实验证明，在原代培养的小鼠皮质神经元中，过表达miR-203导致细胞凋亡增加，同时神经变性相关突触表达也下调[18]。因此，miR-203可能通过参与突触的丢失机制导致认知功能减退。另外，ROC曲线分析表明miR-203对AD有一定的诊断价值，且miR-711和miR-203二者联合检测时AUC最大，AD的诊断效能也得到了进一步提升。

综上所述，本研究检测了miR-711和miR-203在认知障碍性疾病患者血清中的表达，提示两者有望成为疾病诊断的血清学标志物，具有一定的推广及应用潜力。但是，本研究中血清样本量少，也未对aMCI患者进行随访观察其转归情况，因此后期需要扩大样本量进行多中心的临床实验及完善随访研究。此外，本实验组后期还将通过构造细胞及动物模型进一步探索miR-711和miR-203参与认知障碍性疾病发生、发展的分子机制，旨在对疾病的筛查、预防及治疗提供新靶点。