柔肝通络汤对MCAO大鼠内源性干细胞表达的影响∗

及晓梦 龙华君 刘 雨 张珊珊 帅文昊 杨 颖 伍大华

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙410006）

缺血性脑血管病（ICD）约占全部脑血管疾病的60%～80%[1]。缺血性中风后阻碍脑组织血液供应情况，神经元因缺血缺氧发生炎症水肿、变性以致坏死，最终导致中枢神经系统内信息传递功能、整合功能受到破坏甚至缺失。内源性神经干细胞（NSCs）主要分化为神经元、星形胶质细胞和少量少突胶质细胞，具有高度增殖、自我更新以维持自身数目恒定的能力，在神经发育和修复受损神经中发挥重要的作用[2-3]，被认为是修复损伤的基础[4]。现已证明，在成年哺乳动物中，嗅球、大脑皮质、纹状体、海马齿状回、室管膜下区、侧脑室下区、脊髓、视网膜等部位均存在NSCs[5-6]。各项研究表明，成年人大脑内NSCs保持静止状态[7]，在缺血性中风等急性损伤因素的影响下，机体自身的NSCs可被激活，并在多种细胞因子、基因的调控下发生增殖、分化等，进而迁移至神经受损区域，替换损伤坏死的神经元，发挥其代偿和修复功能[8-9]。

柔肝通络汤是湖南省名老中医周慎教授通过总结数十年的临床经验，所创制的治疗中风的经验方。临床证明该方具有改善中风患者神经功能、减少后遗症，降低致残率、改善生活质量等作用[10]。故本实验拟通过大脑中动脉阻塞（MCAO）所致缺血再灌注模型，检测各组各时间点内大鼠脑组织BrdU、BrdU/NeuN、Br⁃dU/GFAP阳性细胞数，观察柔肝通络汤对缺血性脑损伤大鼠内源性神经干细胞增殖和分化的影响，探讨其治疗脑卒中的潜在作用途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物 120只健康SD雄性大鼠，体质量250～300 g，鼠龄为8周，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SYXK（湘）2015-0003。饲养于湖南省中医药研究院中药研究所SPF级实验室，室温18～20℃，湿度65%～70%，自由饮水进食。适应性进食1周后进行实验。

1.2 试药与仪器 柔肝通络汤组方：制首乌15 g，桑椹15 g，枸杞子30 g，丹参30 g，葛根30 g，当归尾10 g，赤芍10 g，地龙10 g，山楂10 g。药材均购自湖南省中医药研究院附属医院，熬制成膏状（含生药2 g/mL）备用。10%水合氯醛、4%多聚甲醛、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU粉末）（武汉BOSTER公司）、Anti-BrdU Mouse mAb、Anti-GFAP Rabbit pAb、Anti-NeuN Rabbit pAb、CY3标记驴抗兔IgG、Alexa488标记山羊抗小鼠IgG（武汉Servicebio公司）。RM2016病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）、YD-A组织摊片机（浙江省金华市益迪医疗设备有限公司）、NIKON ECLIPSE TI-SR倒置荧光显微镜（日本尼康）、TYXH-II涡旋混合器（天悦电子）。

1.3 分组与给药 120只大鼠随机进行编号并分成4组，即空白组、假手术组、模型组、柔肝通络汤组，根据缺血2 h再灌注后6 h、1 d、3 d、7 d、14 d分为5个亚组。各组大鼠数量均为6只。柔肝通络汤组予柔肝通络汤（2.8 g/100 g生药含量[11]），其药物剂量按大鼠14 mL/kg灌胃量用蒸馏水配制（当于50 kg成年人等效计量的2倍），分别按照5个时间点，每日2次灌胃直至大鼠处死。其余组用1.4 mL/100 g蒸馏水灌胃，不添加任何药物。BrdU注射：将BrdU按照50 mg/kg的剂量，10 mg/mL的质量浓度溶于0.9%氯化钠注射液中，每天腹腔注射2次，其中3 d组、7 d组及14 d组于手术后连续注射3 d，而6 h组、1 d组均在处死前3 d注射。

1.4 模型制备 手术前24 h禁食、不禁水。采用改良Longa法[12]制作大鼠MCAO模型。用10%水合氯醛（0.30 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠并将其固定在操作台上。切开颈部正中部皮肤，依次剥离出右颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA）。用线结扎右颈总动脉（CCA）近心端和颈外动脉（ECA），动脉夹夹住颈内动脉（ICA），在动脉夹和颈总动脉近心端结扎之间用眼科剪剪一“V”型小口，将线栓从CCA小口中插入，在分叉处沿着ICA方向向颅脑内上方走行，直至遇到阻力为止。当线栓插入深度约（18.5±0.5）mm时，说明线栓到达大脑前动脉，并成功阻断大脑中动脉。然后扎紧CCA处备线，记录大脑中动脉阻断时间，消毒并缝合皮肤，外留10 mm线栓。于术后2 h轻轻拔出栓线约10 mm，即再灌注模型形成。术中温度始终保持在27℃左右，100 W白炽灯照明维持肛温37～38℃。假手术组大鼠术中操作同上述过程，线栓只插入10 mm左右，此深度不足以阻断大脑中动脉。大鼠苏醒后，按照缺血再灌注5个不同时间点，采用Longa[12]神经功能缺损评分法进行评分，评分1～3分为造模成功。

1.5 神经功能缺损评分 以再灌注6 h、1 d、3 d、7 d、14 d这5个时间点，按照Longa[12]神经功能缺损评分法进行评分。0分：无神经损伤症状。1分：不能完全伸展对侧前爪。2分：向对侧转圈。3分：向对侧倾倒。4分：不能自发行走，意识丧失。大鼠评分越高代表神经功能缺损越严重。0分和4分模型不符合实验要求予以剔除。

1.6 标本采集与检测 造模缺血2 h后，按再灌注6 h、1 d、3 d、7 d、14 d时间点取脑。步骤如下：用10%的水合氧醛（0.30 mL/l00 g）腹腔注射大鼠深度麻醉后将其固定在桌面，开胸，游离出心脏。用止血钳夹住大鼠腹主动脉及下腔静脉，经左心室插入灌流针并固定，切开右心耳，灌注0.9%氯化钠注射直到大鼠肝肺两脏和四肢变白，右心房流出澄清液体，需立即改换灌注4%多聚甲醛PBS 100 mL。断头取脑，将标本放置多聚甲醛中浸泡固定24 h后备用。采用免疫荧光双标法检测BrdU、BrdU/NeuN、BrdU/GFAP免疫阳性细胞。石蜡切片脱蜡至水，置于抗原修复液（pH9.0）中。PBS洗涤3次，每次5 min。加用3%BSA室温封闭30 min。滴加鼠兔一抗，Anti-BrdU（1∶200稀释）、Anti-GFAP（1∶500稀释）、Anti-NeuN（1∶100稀释），置于4℃湿盒内孵育过夜。加荧光二抗Cy3驴抗兔IgG（1∶300稀释）、Alexa488标记山羊抗小鼠IgG，避光室温孵育50 min。滴加DAPI染液，避光室温孵化10 min。加入抗荧光淬灭封片剂封片。倒置荧光显微镜下观察，每张切片选取5个400倍高倍镜视野并采集图像。采用计算机图像分析系统软件（Image-pro plus6.0）计数脑缺血再灌注损伤后各个时间点大脑皮质缺血区域BrdU、BrdU/NeuN、BrdU/GFAP阳性细胞。

1.7 统计学处理 采用SPSS24.0进行分析，所有计量资料以（±s）进行描述，采用多组间单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni法检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况 大鼠脑缺血再灌注后各个时间点的活动较空白组和假手术组减少，体质量减轻，饮食减少。假手术组术中及术后死亡2只，替补2只；模型组死亡5只，失败4只，替补9只；柔肝通络汤组死亡6只，失败3只，替补9只。

2.2 各组大鼠神经功能缺损评分比较 见表1。空白组和假手术组大鼠神经功能缺损评分均为0分。与空白组和假手术组比较，造模后大鼠6 h、1 d、3 d、7 d、14 d的神经功能缺损评分显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，柔肝通络汤大鼠6 h、1 d神经功能缺损评分无显著差异（P＞0.05），3 d、7 d、14 d的神经功能缺损评分较模型组降低（P＜0.05）。

表1 各组大鼠不同时间点肢体神经功能缺损评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠不同时间点肢体神经功能缺损评分比较（分，±s）

与同时间点的模型组比较，∗P＜0.05；与空白组、假手术组同时间点比较，△P＜0.01

组别空白组假手术组模型组柔肝通络汤组n 6 6 6 6 6 h 1 d 3 d 7 d 14 d 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3.000±0.000△2.667±0.817△2.833±0.408△2.667±0.516△2.333±0.516△1.333±0.516△2.167±0.408△1.167±0.408△2.000±0.632△1.000±0.000△

2.3 各组大鼠大脑皮质缺血区Brdu、Brdu/Neun、Brdu/GFAP镜下表达比较 BrdU阳性细胞呈红色（图中显示白色），代表增殖细胞，绿色（图中显示暗灰色）代表神经元和星形胶质细胞，BrdU/NeuN、BrdU/GFAP双标阳性细胞均显示呈橘红色（图中显示浅灰色），代表新生的神经元和星形胶质细胞。见图1～图3。

图3 BrdU/GFAP阳性细胞表达（400倍）

2.4 各组大鼠BrdU单标免疫阳性细胞数比较 见表2，图1。空白组和假手术组在各时间点均可见一定量的BrdU阳性表达，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，柔肝通络汤组大鼠在3、7、14 d的BrdU阳性细胞表达数增加（P＜0.05），尤以3、7 d更显著（P＜0.01），在术后第7日BrdU阳性细胞数达到峰值，随后呈下降趋势，但仍高于模型组。

表2 各组大鼠不同时间点BrdU阳性细胞表达的影响比较（±s）

表2 各组大鼠不同时间点BrdU阳性细胞表达的影响比较（±s）

与同时间点空白组和假手术组比较，#P＜0.01；与同时间点的模型组比较，∗P＜0.05；与本组术后其他时间点比较，△P＜0.01。下同

14 d 35.83±4.02 33.67±4.27 96.50±7.26#117.17±10.83#*组别空白组假手术组模型组柔肝通络汤组n 6 6 6 6 6 h 34.33±4.27 34.67±1.97 36.83±4.40 39.17±4.54 1 d 35.17±2.40 35.83±4.02 55.17±6.77#65.67±12.80#3 d 33.33±2.16 34.50±6.34 74.00±9.10#94.17±9.47#*7 d 36.00±2.68 34.83±7.68 127.50±5.61#△141.17±6.91#*△

2.5 各组大鼠BrdU/NeuN双标免疫阳性细胞数比较见表3，图2。各时间点空白组、假手术组大脑皮质区均可见少量的BrdU/NeuN表达，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，柔肝通络汤组在6 h、1 d的BrdU/NeuN免疫阳性细胞数均无显著差异（P＞0.05），术后3、7、14 d的BrdU/NeuN免疫阳性细胞数均明显增加（P＜0.05）。其中第3～7天增殖迅速，随后增殖缓慢。

表3 各组大鼠不同时间点BrdU/NeuN阳性细胞表达比较（±s）

表3 各组大鼠不同时间点BrdU/NeuN阳性细胞表达比较（±s）

组别空白组假手术组模型组柔肝通络汤组n 6 6 6 6 6 h 14.50±1.64 14.00±2.53 16.33±1.75 16.50±1.76 1 d 15.83±1.83 14.50±3.21 24.00±2.10#26.50±3.21#3 d 15.00±1.79 15.00±1.79 32.83±3.31#37.33±3.08#*7 d 15.67±3.20 14.17±2.14 43.67±2.58#△53.50±3.45#*△14 d 13.50±1.38 15.67±2.25 37.00±4.00#53.83±4.36#*

2.6 大鼠BrdU/GFAP双标免疫阳性细胞数比较 见表4，图3。各时间点空白组、假手术组均可见少量BrdU/GFAP免疫阳性细胞表达，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，柔肝通络汤组大鼠在术后1、3、7、14 d的BrdU/GFAP免疫阳性细胞数均减少（P＜0.05），但仍高于空白组和假手术组。

表4 各组大鼠不同时间点BrdU/GFAP阳性细胞表达比较（±s）

表4 各组大鼠不同时间点BrdU/GFAP阳性细胞表达比较（±s）

组别空白组假手术组模型组柔肝通络汤组n 6 6 6 6 6 h 21.17±3.92 21.33±3.32 23.00±3.52 21.17±3.66 1 d 21.00±2.10 21.17±2.64 30.83±3.49#26.00±2.61#*3 d 21.17±2.14 20.83±1.83 41.17±3.49#32.67±1.63#*7 d 22.17±1.83 22.67±3.01 58.67±3.39#△40.83±2.86#*△14 d 20.83±1.72 20.67±2.66 46.50±3.94#27.83±2.86#*

3 讨论

BrdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，NSCs发生分裂增殖时，它能够代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子中，利用抗BrdU单克隆抗体，经过ICC染色，显示活性增殖细胞，用以标记脑内增殖细胞。既往研究证明，Brdu所标记的阳性细胞中，具有自我更新和分化能力的NSCs占据90%，剩余10%是没有分化能力的神经祖母细胞[13]。所以采用BrdU标记的阳性细胞可表达NSCs增殖情况。

NeuN是一种表达在大多数神经元胞核和胞浆中的一种特异性蛋白质，是新生神经元的标记物；GFAP是一种中间丝蛋白，主要存在于星形胶质细胞内，是中枢神经系统星形胶质细胞的标志物[14]。神经元具有联络和整合输入信息并传递信息的作用，是构成神经系统最基本的结构和功能单位[15]。研究证明，在发生急性损伤如缺血性中风时，可以激活内源性干细胞增殖分化为神经元、星形胶质细胞和少量少突胶质细胞，分化的新神经元能替代和修复受损的神经元，从而改善神经功能[16-17]。星形胶质细胞是脑组织胶质细胞中数量最多、具有重要功能的细胞。其不仅具有营养支持和保护神经元的作用，同时在维持突触周围环境稳态、参与信息传递等方面发挥功能[18]。但星形胶质细胞在促进神经元再生方面具有“双重”作用，在缺血早期，通过抑制炎症因子的扩散，促进神经再生，但在缺血后期，胶质细胞大量增殖重叠，形成胶质疤痕，形成不可逆性组织重构，不仅影响正常局部神经回路，还阻碍神经再生[19]。

缺血性脑血管疾病在中医学属“中风”范畴，本病起病急，变化快，临床症状变化多端，多以突然神昏扑倒地、半身不遂、肢体麻木、口舌歪斜、言语不利，甚者神志不清等为主要表现。中风病位在脑，其主要致病因素归结于风、火、痰、瘀、虚诸端，肝肾亏虚或气血亏虚为其致病根本。周老认为中风之虚主要在于肝肾阴虚，中风之实主要归于瘀血阻滞。方中制首乌为君药，桑葚、枸杞二者同归肝肾经，为臣药，协助均药滋肝补肾阴、养血益精。赤芍、丹参、当归尾、葛根、地龙、山楂均为佐药，共通活血散瘀通络，全方共奏滋补肝肾、育阴息风、活血通络之功效。研究表明，柔肝通络汤经过多年临床疗效观察，柔肝通络汤对于改善中风患者肢体神经功能有显著疗效[11]。综合以上实验结果，说明柔肝通络汤可以促进缺血性脑损伤后内源性干细胞的增殖分化为成熟神经元，抑制胶质细胞的过度增殖，从而促进神经再生。