射干麻黄汤对急性呼吸衰竭模型大鼠的干预效果及作用机制研究∗

陈永昶 林 利 茆俊卿 王 谦 朱 佳△

（1.南京中医药大学扬州附属医院，江苏 扬州 225000；2.南京中医药大学，江苏 南京210000；3.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210000）

急性呼吸衰竭主要是指机体肺功能、换气功能出现严重异常或功能障碍，导致机体气体交换无法正常进行，进而导致机体生理功能异常以及代谢紊乱的症状[1-2]。随着我国人口老龄化现象的不断发展以及我国环境污染问题的日益严重，近年来我国急性呼吸衰竭发病率逐年上升，严重威胁患者的身体健康和生活质量，因此寻找一种安全有效的治疗手段具有重要意义[3-4]。射干麻黄汤常用于呼吸系统疾病的治疗，但是关于其治疗急性呼吸衰竭的临床研究还鲜有报道。本研究中建立急性呼吸衰竭大鼠模型，使用射干麻黄汤进行干预，旨在探究射干麻黄汤对急性呼吸衰竭模型大鼠的干预效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取40只SD健康雄性大鼠，由基尔顿生物科技（上海）有限公司提供，平均月龄（8.9±0.5）月，平均体质量（230.2±10.3）g。在相对湿度30%～35%、温度（23.8±1.5）℃的环境中喂养大鼠1周，光照12 h/d。本研究获我院伦理委员会批准。

1.2 药物与试剂 射干麻黄汤：射干、麻黄、五味子、桔梗、款冬花、紫菀各12 g，党参、制半夏、细辛、生姜各9 g，黄芪30 g，大枣5枚。药材购于本院中药房，将药材于清水中浸泡30 min，加水后使用文火煎90 min，浓缩为1 mL含生药3.84 g的药汁。脂多糖（上海鼓臣生物技术有限公司）；兔抗大鼠白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-17（IL-17）抗体（Sigma公司）；兔抗小鼠超敏C反应蛋白（hs-CRP）抗体（Dako公司）；小鼠抗大鼠GSH-Px抗体（Invitrogen公司）；兔抗小鼠过氧化脂（LPO）抗体（Selleck公司）；大鼠抗小鼠丙二醛（MDA）抗体（Hyclone公司）；大鼠抗兔Bcl-2、Bax抗体（Gibco公司）；小鼠抗兔Caspase3抗体（BD公司）。硫酸阿托品注射液（成都第一药业有限公司）；动物肺功能仪（上海玉研科学仪器有限公司）；冰冻切片机（湖北孝感阔海医疗科技有限公司）；血气分析仪（北京普朗新技术有限公司）。

1.3 模型制备 参照耿维凤等[5]建模方法，随机选取30只大鼠建立急性呼吸衰竭模型：麻醉后将其在操作台上固定，将大鼠支气管暴露于术野之中，并进行插管处理，之后将5 mg/kg大肠杆菌脂多糖滴入支气管中，并根据血气分析结果确定建模成功情况：动脉血二氧化碳分压（PaCO2）<35 mmHg、动脉血氧分压（PaO2）<75 mmHg可判定为建模成功。建模过程中死亡1只，建模失败3只，建模成功26只。

1.4 分组与给药 将26只急性呼吸衰竭大鼠随机分为模型组8只及西药组、射干麻黄汤组各9只，其余10只未作处理大鼠为正常组。正常组、模型组大鼠使用3 mL 0.9%氯化钠注射液进行灌胃处理；西药组大鼠腹腔注射0.1 mL硫酸阿托品注射液，每日1次；射干麻黄汤组大鼠灌胃射干麻黄汤，每日1次，每次3 mL。各组大鼠均连续干预7 d。

1.5 呼吸频率及pH、PaCO2、PaO2水平检测 连续干预7 d后使用动物肺功能仪对各组大鼠呼吸频率进行统计，使用血气分析仪对各组大鼠pH、PaCO2、PaO2水平进行检测。

1.6 标本采集与检测 1）肺组织病理学观察。血气指标检测结束后，采用断头法处死大鼠，取肺组织，置于冰冻切片机上进行包埋处理，-26℃冷冻处理2.5 h后切片，厚度为10 μm，切片置于-20℃下保存。将切片烤干后进行脱蜡处理，置入不同浓度酒精中复水3 min。使用苏木精染色15 min后清洗3次，使用盐酸酒精分化处理30 s，充分清洗之后使用1%伊红染色，酒精脱水处理后进行脱蜡处理，封片后使用显微镜进行观察。2）酶联免疫吸附实验法检测IL-8、IL-17、hs-CRP水平。干预7 d后，取各组大鼠尾部静脉血2 mL，2 000 r/min离心15 min，分离上清液，于-80℃保存。使用酶标仪检测A450值，分析IL-8、IL-17、hs-CRP水平。3）免疫透射比浊法检测GSH-Px、LPO、MDA水平。取已制备血清标本，准备3个试管并分别标记为标准管、测定管及空白管，3个试管中均加入350 μL缓冲液，标准管中加入20 μL GSH-Px、LPO、MDA标准液，测定管中加入20 μL血清，空白管中加入20 μL蒸馏水，3个试管分别摇晃均匀，常温环境静置5～10 min后使用分光光度计进行比色，在500 nm波长处以空白管调零，记录吸光度，对GSH-Px、LPO、MDA水平进行计算。4）Western blotting法检测Bcl-2、Bax、Caspase3表达。取已制备好的肺组织切片标本，使用PBS缓冲液对标本冲洗之后裂解30 min，测定蛋白浓度。按20 μg/孔添加蛋白缓冲液后进行电泳，10 min后将电转膜置于10%的牛奶中浸泡，常温环境下封闭90 min。之后结合一抗、稀释，孵育1 d，取出后使用TBST液冲洗，结合二抗，60 min后清洗、显色，对Bcl-2、Bax、Cas⁃pase3表达进行检测。

1.7 统计学处理 应用SPSS21.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠呼吸频率及pH、PaCO2、PaO2水平比较见表1。模型组、西药组、射干麻黄汤组大鼠呼吸频率显著低于正常组，西药组、射干麻黄汤组大鼠呼吸频率高于模型组，且射干麻黄汤组大鼠呼吸频率高于西药组（均P＜0.05）；模型组、西药组、射干麻黄汤组大鼠pH、PaCO2、PaO2水平显著低于正常组，西药组、射干麻黄汤组大鼠pH、PaCO2、PaO2水平高于模型组，且射干麻黄汤组大鼠pH、PaCO2、PaO2水平高于西药组（P＜0.05）。

表1 各组大鼠呼吸频率及pH、PaCO2、PaO2水平比较（±s）

表1 各组大鼠呼吸频率及pH、PaCO2、PaO2水平比较（±s）

与正常组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与西药组比较，△P＜0.05。下同

组别正常组模型组西药组射干麻黄汤组n 1093.8 39.9 79.986.呼吸频率（次/min）35±6.58 11±3.06*12±5.62*#22±6.01*#△pH 7.40±0.11 7.03±0.06*7.18±0.07*#7.29±0.09*#△PaCO2（mmHg）43.02±2.19 30.26±1.35*38.51±1.62*#41.12±1.95*#△PaO2（mmHg）81.67±3.26 53.26±2.34*65.99±2.87*#74.66±3.12*#△

2.2 各组大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平比较 见表2。模型组、西药组、射干麻黄汤组大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平高于正常组（P＜0.05）；西药组、射干麻黄汤组大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平低于模型组，且射干麻黄汤组大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平低于西药组（P＜0.05）。

表2 各组大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平比较（±s）

表2 各组大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平比较（±s）

组别正常组模型组西药组射干麻黄汤组n 102 8 6 9 3 93 IL-8（pg/mL）6.35±3.12 2.29±5.98*5.09±4.12*#1.22±3.61*#△IL-17（ng/L）8.26±1.42 27.51±3.42*13.97±2.13*#11.59±1.98*#△hs-CRP（ng/mL）4.11±0.71 13.25±2.46*8.22±1.23*#6.15±0.85*#△

2.3 各组大鼠GSH-Px、LPO、MDA水平比较 见表3。模型组、西药组、射干麻黄汤组大鼠GSH-Px水平低于正常组，LPO、MDA水平高于正常组（P＜0.05）；西药组、射干麻黄汤组大鼠GSH-Px水平高于模型组，LPO、MDA水平低于模型组，且射干麻黄汤组大鼠GSH-Px水平高于西药组，LPO、MDA水平低于西药组（P＜0.05）。

表3 各组大鼠GSH-Px、LPO、MDA水平比较（±s）

表3 各组大鼠GSH-Px、LPO、MDA水平比较（±s）

组别正常组模型组西药组射干麻黄汤组n 1081.5 8 52.3 9 65.1 973.5 GSH-Px（U/L）2±7.66 9±4.60*1±5.72*#1±6.97*#△LPO（U/mg）0.06±0.01 0.22±0.05*0.13±0.02*#0.08±0.01*#△MDA（μmol/L）19.56±2.08 37.30±3.72*27.59±2.67*#23.51±2.32*#△

2.4 各组大鼠Bcl-2、Bax、Caspase3表达比较 见表4、图1。模型组、西药组、射干麻黄汤组大鼠Bcl-2、Caspase3表达均高于正常组，Bax表达低于正常组（P＜0.05）；西药组、射干麻黄汤组大鼠Bcl-2、Caspase3表达均低于模型组，Bax表达均高于模型组，且射干麻黄汤组大鼠Bcl-2、Caspase3表达低于西药组，Bax表达高于西药组（P＜0.05）。

表4 各组大鼠Bcl-2、Bax、Caspase3表达比较（±s）

表4 各组大鼠Bcl-2、Bax、Caspase3表达比较（±s）

组别正常组模型组西药组射干麻黄汤组n 10 8 9 9 Bcl-2 0.96±0.13 1.68±0.31*1.32±0.18*#1.10±0.15*#△Bax 1.20±0.16 0.41±0.03*0.88±0.09*#1.05±0.12*#△Caspase3 1.06±0.10 1.73±0.29*1.34±0.17*#1.19±0.12*#△

图1 各组Bcl-2、Bax、Caspase3表达条带

2.5 各组大鼠肺组织病理学观察 见图2。正常组肺泡大小均匀、结构完整，肺泡间隔一致，无增厚现象；支气管上皮组织未出现炎性细胞浸润现象。模型组肺泡间隔增加，肺泡毛细血管壁发现充血，有炎性细胞浸润，有部分肺泡出现水肿。射干麻黄汤组肺泡腔内干净，细胞间隔未见增厚，炎性细胞浸润程度明显下降，未见肺泡水肿、毛细血管充血情况。

图2 各组大鼠肺组织病理学观察图（HE染色，100倍）

3 讨论

目前临床常使用西医治疗手段对急性呼吸衰竭患者进行治疗，但是临床治疗效果并不理想，因此大多数专家学者开始致力于中医药治疗急性呼吸衰竭的研究[6]。中医学将急性呼吸衰竭症状归于“肺胀”范畴，主要表现为肺气亏虚。射干麻黄汤由射干、麻黄、党参、黄芪、五味子、桔梗、款冬花、生姜等组成。射干、麻黄具有开郁、宣肺、化痰、平喘的功效；党参、黄芪等具有滋阴、润肺、益气的功效；以五味子、桔梗、款冬花、生姜等相佐，能够起到较为理想的健脾、宣肺、益气、平喘、化痰的功效[7-8]。

急性呼吸衰竭症状的发生发展会使机体pH、PaCO2、PaO2等血气指标水平出现明显的异常，对pH、PaCO2、PaO2水平进行检测，能够对急性呼吸衰竭症状严重程度以及临床治疗效果进行较为准确的评价[9-10]。本研究结果显示，相比正常大鼠，急性呼吸衰竭大鼠呼吸频率以及pH、PaCO2、PaO2水平较低，使用射干麻黄汤对急性呼吸衰竭大鼠进行干预，大鼠呼吸频率及pH、PaCO2、PaO2水平明显上升而趋于正常水平，说明使用射干麻黄汤进行干预能够改善急性呼吸衰竭大鼠呼吸功能及血气指标水平。

大量实验研究表明，急性呼吸衰竭症状的发生发展伴随着机体炎症反应[11-12]。IL-8、IL-17、hs-CRP是广谱的炎性指标。IL-8能够吸引、激活中性粒细胞，诱发机体局部炎症反应，对机体组织细胞造成损伤[13]。IL-17是一种致炎因子，由活化的T细胞产生，能够促进IL-6、IL-8等炎症因子的生成，进而诱发炎症反应[14]。hs-CRP主要由肝脏组织合成，是一种广谱的机体炎症反应标志物[15]。本研究结果显示，相比正常大鼠，急性呼吸衰竭大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平明显较高，说明急性呼吸衰竭大鼠肺组织存在较为严重的炎症反应。使用射干麻黄汤进行干预后IL-8、IL-17、hs-CRP水平明显下降，说明射干麻黄汤干预能够抑制IL-8、IL-17、hs-CRP水平，减轻大鼠肺组织炎症反应，从而起到肺保护作用。

呼吸衰竭症状的发生发展与机体氧化应激损伤具有密切联系[16-17]。GSH-Px、LPO、MDA是临床较为常用的评价机体抗氧化能力的指标，其表达水平的变化与机体氧化应激损伤严重程度密切相关。本研究结果显示，相比正常大鼠，急性呼吸衰竭大鼠GSH-Px水平较低，LPO、MDA水平较高，说明急性呼吸衰竭症状的发生发展伴随着肺组织细胞氧化应激损伤，使用射干麻黄汤进行干预的急性呼吸衰竭大鼠GSH-Px水平上升，LPO、MDA水平下降，说明射干麻黄汤能够调控GSH-Px、LPO、MDA水平，减轻大鼠肺组织氧化应激损伤，从而起到较为理想的肺保护作用。

呼吸衰竭症状的发生发展与机体肺组织细胞凋亡密切相关。Bcl-2、Bax、Caspase3表达的变化与细胞凋亡能力密切相关。Bcl-2、Bax是线粒体细胞凋亡通路中的重要基因，二者表达水平的变化与细胞凋亡密切相关[18-19]。Caspase家族与细胞凋亡密切相关，Cas⁃pase3是Caspase家族的重要一员[20]。本研究结果显示，使用射干麻黄汤对急性呼吸衰竭大鼠进行干预，Bcl-2、Caspase3表达出现下调，Bax表达出现上调，说明射干麻黄汤能够调控Bcl-2、Bax、Caspase3表达，抑制急性呼吸衰竭大鼠肺组织细胞凋亡，从而起到肺保护作用。

综上所述，使用射干麻黄汤对急性呼吸衰竭大鼠进行干预，能够改善大鼠呼吸频次及血气水平，减轻大鼠炎症反应及氧化应激损伤，抑制肺组织细胞凋亡，从而起到一定的肺保护作用，为急性呼吸衰竭的临床治疗提供参考依据。