Box-Behnken响应面法优化虎杖苷的提取工艺及体外活性评价∗

郑燕飞 郭 莹

（浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）

虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.）为蓼科植物虎杖的干燥根及根茎，味微苦、药性平，归肝、胆、肺经，虎杖药用历史悠久，入药始见于《雷公炮炙论》[1]。虎杖苷（Polydatin，PD）是从虎杖的干燥根茎中提取的单体，它是虎杖的重要生物活性成分之一[2]。现代研究表明，虎杖具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗血栓、抗氧化等多种药理作用[3]。本实验采用乙醇提取虎杖中的虎杖苷，在单因素试验基础上考察影响虎杖苷得率的主要提取因素，通过响应面法优化虎杖苷的提取工艺，并对虎杖提取物进行体外抗氧化和抑菌活性评估，以期为虎杖中活性成分的进一步研究奠定物质基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

FA2104N电子分析天平：上海菁海仪器有限公司；TU-1900双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；RE-5298旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；Spectra Max M3酶标仪：美国MD公司；超净工作台：SW-CT-2G型，净化仪器有限公司；手提式压力蒸汽灭菌锅：YXQ-LH-18SI型，北京迅博仪器有限公司；恒温培养箱：SBX-250B-Z型，博迅医疗设备有限公司。

1.2 材料

虎杖：浙江中医药大学中药饮片有限公司，批号180301；虎杖苷对照品：上海源叶生物科技有限公司，批号ZM0530LA14，纯度7.18%；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（浙江中医药大学生命科学学院发酵工程实验室提供）；LB培养基为实验室自制，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 虎杖苷含有量测定

2.1.1 供试品溶液制备[4]精密称取虎杖粗粉4.0 g（过50目筛），采用乙醇回流法于不同因素下提取，趁热过滤，滤液旋蒸后加入甲醇溶剂定容至50 mL，紫外分光光度计于305 nm处检测其吸光值。

2.1.2 标准曲线制备 精密称取虎杖苷对照品3.0 mg，定容至50 mL，充分混匀，得到0.06 mg/mL的原液，稀释成不同质量浓度，测量得到标准曲线：Y=0.0747X+0.0877，R2=0.9995，在1.5～24 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2 单因素试验[5]

2.2.1 乙醇体积分数 取虎杖粉末4.0 g，固定提取时间1 h，液料比10 mL/g，温度为60℃，分别加入50%、60%、70%、80%、90%、95%乙醇，测定虎杖苷含有量，结果可知，乙醇体积分数在50%～95%时，溶液中虎杖苷含有量基本保持不变，在70%时达到最大值，随后有所下降至基本不变。

2.2.2 提取温度 取虎杖粉末4.0 g，固定提取时间1 h，液料比10 mL/g，乙醇体积分数60%，分别于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴中提取，测定虎杖苷含有量，结果可知，在50～90℃时，随温度的升高，溶液中虎杖苷含有量有所增加，直至温度升高至70℃后基本保持不变。

2.2.3 料液比 取虎杖粉末4.0 g，固定提取时间1 h，乙醇体积分数60%，提取温度为60℃，料液比分别为5、10、15、20、25 mL/g提取，测定虎杖苷含有量，结果可知，溶液中虎杖苷含有量随着乙醇量的增加表现为先增加后减小，其中在液料比为15 mL/g时达到最大值。

2.2.4 提取时间 取虎杖粉末4.0 g，固定乙醇体积分数60%，提取温度为60℃，料液比1∶10，提取时间为0.5、1、1.5、2、2.5 h，测定虎杖苷含有量，结果可知，溶液中虎杖苷含有量随着提取时间的增加略微有所增加，随后有所下降至基本不变。

2.3 Box-Behnken响应面法

由单因素试验可知提取温度（因素A）、时间（因素B）、料液比（因素C）这3个因素对虎杖苷的提取得率影响较大，因此选用这3个因素进行工艺的优化，在乙醇体积分数为60%的条件下，以虎杖苷含有量（Y）为评价指标，设计三因素三水平试验，采用Design-Expert软件对实验数据进行分析[5]，由Y=0.0747X+0.0877方程计算出虎杖苷含有量。因素水平见表1，结果见表2。

表1 响应面优化试验因素水平表

表2 响应面优化试验设计结果

表3 方差分析

通过Design-Expert软件对表2数据进行分析，得到方程Y=+44.99-0.059A-1.05B+2.08C+2.58AB+0.19AC-1.53BC-2.97A2-2.77B2-3.42C2，方差分析见表3，由表可知，模型P＜0.0001，差异极显著，具有统计学意义；失拟项P＞0.05，表明模型拟合度良好；B、C、AB、BC、A2、B2、C2差异显著（P＜0.05），其他项不显著（P＞0.05），各因素影响程度依次为C>B>A。

响应面分析见图1～图3，由图可知，温度与液料比的响应面的曲面较陡，表明其交互作用对虎杖苷含有量的影响显著，而与提取时间、液料比与温度的响应面的曲线较平滑，表明其交互作用对虎杖苷含有量的影响较小，可知液料比和提取温度之间交互作用有明显影响。

图1 温度与时间对虎杖苷含有量影响的响应面图（a）与等高线图（b）

图2 液料比与时间对虎杖苷含有量影响的响应面图（a）与等高线图（b）

图3 液料比与温度对虎杖苷含有量影响的响应面图（a）与等高线图（b）

2.4 最优提取工艺

通过Design-Expert软件分析得最佳提取工艺为：提取温度77.54℃、提取时间1.54 h、液料比16.53 mL/g以及乙醇浓度60%。

2.5 虎杖提取物体外抗氧化活性实验[6]

精密移取20 mg/mL虎杖提取物，分别稀释至8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL，取各提取液20 μL于96孔板中，加入180 μL 0.1 g/mL DPPH溶液，以60%乙醇作空白对照，Vit c作阳性对照，避光反应30 min，于517 nm处测量吸光度，并计算清除率。重复实验3次，结果如图4所示。可知虎杖提取物质量浓度在0.125～4 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除率随质量浓度的增加而增大，当质量浓度达到4 mg/mL后，对DPPH自由基的清除率基本保持不变，可达90%。

图4 不同质量浓度虎杖提取物DPPH清除率实验结果

2.6 虎杖提取物体外抑菌活性实验

2.6.1 最小抑菌浓度（MIC）测定 参照文献[7]方法。采用二倍比稀释法将虎杖提取物稀释成系列梯度浓度，取10 μL菌液（约1×107cfu/mL）均匀涂布在90 mm LB琼脂培养基上，每板放置牛津杯，各孔加入100 μL的药液，以青霉素钠作阳性对照，60%乙醇为空白对照，37℃恒温培养18 h，观察测量抑菌圈直径，并判断MIC，完全没有抑菌直径的最低药物质量浓度即为MIC。多次实验结果取平均值，结果见表4、图5。由图可知，优化工艺下得到的虎杖提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有抑制作用，随着虎杖提取物质量浓度的提高抑菌圈直径逐渐增大，且金黄色葡萄球菌的抑菌圈大于枯草芽孢杆菌，对大肠杆菌抑制效果不明显。

表4 不同质量浓度虎杖提取物对细菌的抑制作用（mm，±s）

表4 不同质量浓度虎杖提取物对细菌的抑制作用（mm，±s）

菌种阴性对照金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌大肠杆菌n 3 3 3 MIC（mg/mL）15.625 15.625-虎杖提取物（mg/mL）500 17.47±1.38 15.83±0.56-250 17.25±1.13 15.54±0.65-125 15.38±1.63 14.13±1.51-阳性对照37.31±1.59 37.14±0.42 15.81±1.93- - -

图5 虎杖提取液对细菌的抑制作用

2.6.2 细菌生长抑制量-时曲线 参照文献[8]方法。在含2MIC、MIC、1/2MIC的含药培养基中接种1%（体积分数）对数期菌液，以不含药的相应培养基接种1%（体积分数）对数期菌液作为空白对照，37℃，180 r/min摇床培养。4 h后，每隔1小时测菌液吸光度；以时间（h）为横坐标，波长600 nm处菌液吸光度，A600nm为纵坐标绘制细菌生长曲线，结果见图6。由图可知，对照组中的两个菌株表现出典型的正常细菌生长曲线，不同质量浓度虎杖提取物对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌生长表现出不同程度的抑制作用，但两种菌的总体生长周期并无明显变化，其中2MIC虎杖提取液对两种菌株的生长有明显的抑制作用，使其无法进入对数生长期，生长曲线趋于平缓。

图6 不同质量浓度虎杖提取物对细菌生长曲线的影响

3 讨论

虎杖是一味传统中药，具有清热解毒、活血化瘀的功效，主要成分包括二苯乙烯类、蒽醌类、黄酮类、酚类等，虎杖苷是白藜芦醇与葡萄糖结合的产物，也称为白藜芦醇苷，具有良好的稳定性，其药理作用与白藜芦醇类似，两者可在体内相互转化[9]。本实验通过响应面法优化得到虎杖苷最佳回流提取条件：温度77.54℃，乙醇体积分数60%，液料比16.53 mL/g，提取时间1.54 h。单因素实验结果显示，乙醇浓度过高，溶液中虎杖苷含有量并未增加，这可能由于乙醇浓度过高使植物细胞失水，有效成分不易扩散，从而降低虎杖苷的提取率[10]；同时液料比过高或过低都不利于虎杖苷的提取，可能通过影响虎杖细胞的移动和虎杖苷从细胞中释放，使溶解度下降，降低虎杖苷的得率[11]。

在抗氧化实验中，虎杖提取物表现出良好的抗氧化能力，当质量浓度为4 mg/mL时，对DPPH的清除率可达到90%，与其他中药相比，具有明显优势[12]。近期研究表明[13]，虎杖苷在脑缺血、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝等疾病的治疗中发挥一定作用，具有减轻机体脂质过氧化、降低氧化损伤的作用。虎杖苷具有3个酚羟基，也提示其具有抗氧化活性，可通过进一步分析虎杖提取物中的组分探究其发挥抗氧化作用的主要活性物质，为相关疾病的治疗提供物质基础。

在抑菌实验中，虎杖提取物对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有一定抑制作用，并呈剂量依赖性，对大肠杆菌的抑制作用不明显。金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，两者属于常见的致病菌，大肠杆菌为革兰氏阴性菌，属于条件致病菌。研究表明，虎杖中的虎杖苷、大黄素等具有抗菌活性，其可通过抑制细菌神经氨酸酶活性，阻断细菌细胞壁、细胞膜的形成，破坏膜的完整性从而抑制细菌的生长[14-15]。虎杖提取物对于大肠杆菌并不敏感，这可能与革兰氏阴性菌表面多层结构的细胞壁有关，阻碍了药物通过外膜到达作用靶点，也可能与提取物未进一步纯化有关。细菌生长抑制曲线是动态衡量抗菌药物抗菌活性的定量指标，可以反映抗菌药物作用于细菌不同时间后细菌的生长情况。结果显示虎杖提取物在MIC和2 MIC条件下，分别对两种菌株的生长有不同的抑制作用，其可能通过破坏细胞膜的结构或功能影响细菌的正常代谢活性和生理功能，阻断细菌进入对数期所需核酸和蛋白质的合成，从而抑制其生长[16]。

中药具有成分复杂、作用靶点多等特点，且毒副作用相对小，虎杖中含有多种活性成分，药理作用广泛，其多组分之间是否存在协同起效的可能，虎杖提取物中发挥抗氧化作用的主要有效成分是什么，抑菌的具体作用机制如何，药物进入体内发挥药理作用效果是否与体外一致，有待进一步研究。