一株产耐高温蛋白酶蜡样芽胞杆菌的分子鉴定和酶学性质研究

佘新松 邵建扬 孙春巧 方茹月 储雅琪 江治萍 代雨婷 柏晓辉

(1黄山学院生命与环境科学学院，安徽 黄山 245041；2绩溪县林业局，安徽 宣城 245300)

蛋白酶是能水解蛋白质的一种生物催化剂，其催化反应速度快、条件温和、环保无污染，被广泛应用于制革、食品、医药卫生及化妆品等行业。 在制革工业中，蛋白酶用于去除原料皮残肉、胶原间隙蛋白和类粘蛋白，使处理后的皮革柔软[1]；在食品工业上，蛋白酶主要用于嫩化肉类、水解蛋白质制备调味液、制作干酪等[1]；在医药卫生领域，中性蛋白酶用于水解藏羊血清蛋白来制备抗氧化肽[2]，也可用于制备抗癌药物中间体[3]等；中性蛋白酶还可用于生产去除老化角质的化妆品[4]。

蛋白酶广泛存在于动物、植物及微生物组织中[5]。 受动植物资源的限制，目前工业用蛋白酶主要来源于微生物发酵[1，6-7]，其所用微生物主要为细菌、霉菌、少量酵母菌和放线菌[8-9]。 已有研究表明，产蛋白酶的细菌菌株主要包括枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)[10-11]、短芽孢菌属(Brevibacillus)[12-13]和盐单胞菌属(Halomonas)[14]。根据最适反应pH 值，蛋白酶可分为酸性(pH 值2.0～6.0)、中性(pH 值6.0 ～9.0)和碱性(pH 值9.0 以上)三大类[1]，其中中性蛋白酶研究最早，研究得较为清楚[4]；然而，目前还鲜有文献报道能耐受60℃及以上高温的中性蛋白酶。

为筛选产耐高温蛋白酶的菌种，本研究以黄山学院校园林地的根际土壤为材料，采用酪素固体培养基筛选法筛出一株产蛋白酶菌株HSU-2，通过生理生化试验及16SrDNA 序列测定予以鉴定，并对其酶学性质进行研究，以期为该菌种的工业化应用和蛋白酶的大规模生产及应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品 土壤采自黄山学院校园内树林下，距离表层土壤约5 cm 处；用采样铲挖开表层土壤后，取出根际土壤放入已灭菌的锥形瓶中，带回实验室备用。

1.1.2 试验仪器 超净工作台(ZHJH-C2109B，上海智城)、恒温培养箱(MQD-B2R，上海旻泉)、高压灭菌锅(SQ510C，重庆雅马拓)、培养箱(ZGP-2050，上海智城)、三孔恒温电热水槽(DK-8D，上海匡贝实业)、紫外可见分光光度计(UV-765，上海精密科学仪器)、离心机(AvantiJ-E，美国贝克库尔特公司)。

1.1.3 试剂 胰酶解酪蛋白(trypticase)、干酪素、蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、淀粉、甲基红、草酸铵结晶紫、番红和碘液、过氧化氢(H2O2)、十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、聚乙二醇辛基苯基醚(triton X-100)、吐温80(tween 80)购于上海生工公司；NaCl、ZnCl2、Na2HPO4·7H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4、KH2PO4、甘油和95%乙醇等购于上海国药集团。

1.1.4 培养基 酪素筛选固体培养基配制参照万文结等[15]的配方，种子活化培养基和发酵培养基配制参照Cui 等[16]的配方。

1.2 方法

1.2.1 产蛋白酶菌株的分离与纯化 称取1.0 g 采集的土壤，加入到含有活化培养基的锥形瓶中，摇匀后置于80℃水浴锅中保温10 min；然后将其放置在28°C、 180 r·min-1振荡培养箱中恒温培养24 h。 剩余的土样密封保存，备用。 将培养24 h 的培养液再次置于80 ℃水浴锅中保温10 min，采用10 倍稀释法将上述增殖后培养液依次稀释至10-3、10-4和10-5。 分别移取100 μL 稀释液涂布于酪素固体培养基上，置于28℃恒温箱中培养24 h，观察酪素固体培养基上菌落周围的透明水解圈，测量透明圈直径(H)和菌落直径(C)，选取H/C 比值大的菌落进行纯化，利用划线法对上述菌落进行多次纯化，直至纯化出单菌落，且菌落特征稳定。 根据H/C 比值，对纯化后的菌落进行编号，并保存备用。

1.2.2 产蛋白酶菌株的鉴定 取上述步骤纯化后H/C 比值最大的编号为HSU-2 菌株进行菌落形态特征观察，并参照《常见细菌系统鉴定手册》[17]在牛肉膏蛋白胨培养基中分别添加淀粉、甲基红溶液及不同浓度NaCl 溶液制备成不同固体培养基，观察菌株HSU-2生长情况；同时观察该菌株对H2O2的水解能力，并鉴定其生理生化特征。 提取菌株的基因组DNA，并委托苏州金唯智(GENEWIZ)公司利用通用测序引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-TA CGGC T A C C T T G T T A C G A C TT-3′对该菌株的16SrDNA 序列进行扩增和测定。 将测序获得的16SrDNA序列放入NCBI 数据库中比对，选择序列一致性在99.43%以上的菌株序列，利用序列比对软件Clustal X 2.1[18]和进化分析软件MEGA 6.06[19]构建分子进化树[20-21]，鉴定该菌株的种类。

1.2.3 酪蛋白标准曲线的绘制 参考柏晓辉等[22]的方法配制酪蛋白标准溶液，并根据280 nm 波长处吸光值制作酪蛋白标准曲线，重复3 次。 本研究测定的酪蛋白溶液浓度(X)与其吸光值(Y)的回归方程为:Y=1.164 7X+ 0.006 1(R2=0.999 8)。

1.2.4 蛋白酶粗酶液制备 从-80℃冰箱中取出保存的菌株HSU-2(该菌株的相关研究结果已向国家知识产权局申请专利保护)，用种子活化培养基活化12 h 后，将菌种接种至发酵培养基中，于28℃、180 r·min-1摇床中恒温发酵5 d。 吸取发酵后培养液，于8 000 r·min-1离心5 min，上清液即为粗酶液。

1.2.5 蛋白酶的最佳反应pH 值 参照柏晓辉等[22]的方法测定蛋白酶的最佳反应pH 值。 分别取pH 值为4、5、6、7、8、9 的缓冲液3.5 mL，加入10 mg·mL-1酪蛋白溶液0.5 mL，再加入1 mL 粗酶液，混合均匀后将反应液置于37℃水浴恒温反应20 min。 取出反应液，加入1 mL 20% (w/v) 三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)充分混匀，终止反应。 在加入酪蛋白前，先用TCA 将粗酶液失活，作为对照组。 将TCA 终止反应后的反应液配平，并于12 000 r·min-1离心5 min，小心吸取上清液于280 nm 波长处测定吸光值，重复3 次，取平均值。 将试验组数据减去对照组，并根据上述酪蛋白标准曲线计算出该蛋白酶的酶活力。 酶活力单位定义为每毫升酶液在一定pH 和温度下，每分钟分解酪蛋白产生1 μg 酪氨酸为一个酶活力单位，以U·mL-1或U·g-1表示[23]。

1.2.6 蛋白酶的最佳反应温度 配制上述步骤中测定的最佳pH 值缓冲液，取52.5 mL 该缓冲液至250 mL 烧杯中，分别向该缓冲液中依次加入10 mg·mL-1酪蛋白溶液7.5 mL，粗酶液15 mL，混合均匀后每试管分装5 mL，分别放置于30、40、50、60 和70℃恒温水浴锅中反应20 min，然后依次加入1 mL 20% TCA 终止反应；配平后12 000 r·min-1离心5 min，吸取上清液于280 nm 波长处测定吸光值，重复3 次，取平均值。

1.2.7 H2O2对蛋白酶酶活力的影响 分别在最佳pH 值缓冲液中加入浓度分别为1%、5%和10% (v/v)的H2O2并定容至3.5 mL，加入1 mL 粗酶液，混匀后将溶液置于冰上分别处理20、40 和60 min；然后分别加入10 mg·mL-1酪蛋白溶液0.5 mL，混匀后将反应液置于最佳反应温度下水浴20 min，加入1 mL 20% TCA终止反应；配平后12 000 r·min-1离心5 min，吸取上清液于280 nm 波长处测定吸光值，重复3 次。 同时，以不加H2O2的粗酶液为对照，按以上步骤测定其酶活力并将其设为100%，比较H2O2对该蛋白酶酶活力的影响。

1.2.8 去污剂对蛋白酶酶活力的影响 在最佳pH值缓冲液中加入浓度分别为0.5%、1.0%、2.5%和5.0% (w/v)的SDS、Triton X-100 或Tween 80 并定容至3.5 mL，加入1 mL 粗酶液，混匀后将溶液置于冰上分别处理20、40 和60 min；按照1.2.7 方法比较去污剂对该蛋白酶酶活力的影响。

1.2.9 金属离子对蛋白酶酶活力的影响 按照1.2.6 方法测定加入1 mmol·L-1MgCl2、ZnCl2、KCl、NiCl2和CaCl2处理5 min 后的酶活力，比较金属离子对蛋白酶酶活力的影响。

2 结果与分析

2.1 菌株HSU-2 的分子鉴定

采用透明圈法从土壤样品中筛选到一株产耐高温蛋白酶的菌株HSU-2(图1)。 该菌株在酪素筛选固体培养基上形成明显的透明水解圈，且H/C 比值约为4.1。 该菌株在酪素固体培养基上形成的菌落呈圆形且较干燥，菌落中间微白、四周微黄。 部分生理生化指标检测发现，该菌株的淀粉水解实验、接触酶实验、甲基红实验均为阳性，该菌生长过程不需要NaCl 或仅能在1% NaCl 培养基上生长，而5%或10% 的NaCl 会抑制该菌株的生长(表1)。

表1 菌株HSU-2 的生理生化试验结果Table 1 Physiological and biochemical results of strain HSU-2

图1 菌株HSU-2 的菌落特征Fig.1 Colony characteristics of strain HSU-2

利用通用引物27F 和1492R 扩增菌株HSU-2 的16SrDNA 序列用于测序分析，结果显示，菌株HSU-2的16SrDNA 序列约为1 407 bp。 将获得的序列放入NCBI 数据库中用BLAST 工具进行同源性分析，比对结果显示，与菌株HSU-2 序列同源性较高的菌株来源于芽孢杆菌属(Bacillussp.)。 从比对结果中选择与菌株HSU-2 序列一致性均为99.43%以上的菌株序列，利用软件ClustalX 2.1 进行多序列比对，同时参照文献[20-21]的方法构建分子进化树(图2)。 结果表明，菌株HSU-2 与Bacillus cereusstrain JCM 2152 等5 株蜡样芽孢杆菌位于相同的进化树分支上。 结合以上菌株的菌落、部分生理生化特征及16SrDNA 进化分析结果，将菌株HSU-2 鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。

2.2 pH 值对蛋白酶酶活力的影响

由图3 可知，酸性(pH 值＜5)条件下菌株HSU-2产蛋白酶酶活力较低；当反应液pH 值升高至7 时，其酶活力明显升高至最大值(311.85 U·mL-1)；当pH 值继续升高至偏碱性(pH 值8 ～9)时，该蛋白酶活力有所降低。 与偏酸性条件相比，该蛋白酶在偏碱性条件仍可维持较高的酶活力。 以上结果表明，菌株HSU-2产蛋白酶的最佳反应pH 值为7，且在一定范围内具有耐碱性。

2.3 温度对蛋白酶酶活力的影响

在上述试验测定的菌株HSU-2 产蛋白酶最佳反应pH 值7 条件下，测定不同温度(30、40、50、60 和70℃)对该蛋白酶酶活力的影响(图4)。 结果表明，温度为30～60℃时，蛋白酶酶活力随着温度的升高而升高，且在温度为60℃时达到最大，为418.10 U·mL-1； 当温度继续升高，蛋白酶酶活力开始下降。 因此，菌株HSU-2 产蛋白酶最佳反应温度为60℃。

2.4 其他因素对蛋白酶酶活力的影响

图2 基于16S rDNA 序列比对结果构建菌株HSU-2 的分子进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of HSU-2 and representatives

图3 pH 值对酶活力的影响Fig.3 Effect of pH value on enzyme activity

图4 温度对酶活力的影响Fig.4 Effect of temperature on enzyme activity

2.4.1 H2O2对蛋白酶酶活力的影响 以pH 值7.0、反应温度60℃时的蛋白酶酶活力为100%，检测不同浓度H2O2对菌株HSU-2 产蛋白酶酶活力的影响，结果如图5。 1% H2O2可提高菌株HSU-2 产蛋白酶的酶活力，而5%或10% H2O2可降低菌株HSU-2 产蛋白酶的酶活力。 同时，随着H2O2处理时间的延长，1%、5%和10% H2O2均会不同程度地降低菌株HSU-2 产蛋白酶的酶活力。

图5 过氧化氢对酶活力的影响Fig.5 Effect of H2O2 on enzyme activity

2.4.2 3 种去污剂对蛋白酶酶活力的影响 以pH 值7.0、反应温度60℃时的蛋白酶酶活力为100%，检测3种不同种类及浓度的去污剂对菌株HSU-2 产蛋白酶酶活力的影响。 由图6-A 可知，当去污剂SDS 浓度分别为0.5%、1.0%和2.5%时，处理该蛋白酶20 min 对其酶活力无显著影响；随着处理时间延长至40、60 min，3 种浓度的SDS 仍对该蛋白酶的酶活力无显著影响。 而当SDS 浓度升高至5.0%时，处理不同时间后使得该蛋白酶的酶活力略有降低，但酶活力仍维持在95%以上。

由图6-B 可知，去污剂Triton X-100 浓度分别为0.5%、1.0%和5.0%时，菌株HSU-2 产蛋白酶的酶活力略微提高；且随着处理时间延长至40、60 min，该蛋白酶的酶活力均可维持在100%以上。

由图6-C 可知，当去污剂Tween 80 浓度分别为0.5%、1.0%和5.0%时处理该蛋白酶20 min，该蛋白酶的酶活力可提高至115.8%～122.7%；处理40 min，该蛋白酶的酶活力提高至123.3%～133.6%；处理60 min，该蛋白酶的酶活力仍维持在119.6%～126.6%。

图6 去污剂十二烷基磺酸钠(A)、聚乙二醇辛基苯基醚X-100(A)和吐温80(C)对酶活力的影响Fig.6 Effects of detergents sodium dodecyl sulfonate(A)，Triton X-100(B)，and Tween 80(C) on enzyme activity

2.4.3 金属离子对蛋白酶酶活力的影响 以pH 值7.0、反应温度60℃时的蛋白酶酶活力为100%，检测终浓度为1 mmol·L-1的Mg2+、Zn2+、K+、Ni2+等对该蛋白酶酶活力的影响(图7)。 结果表明，Mg2+、Zn2+、K+、Ni2+和Cu2+5 种金属离子可明显降低该蛋白酶的酶活力，其中Zn2+抑制作用最强，酶活力降低至34.0%；Ni2+和Cu2+抑制作用次之，酶活力分别降至50.5%和45.2%；Mg2+和K+抑制作用较弱，酶活力分别降至85.8%和81.0%。 相反，Ca2+可提高该蛋白酶的酶活力至116.5%。

图7 金属离子对酶活力的影响Fig.7 Effects of metal ions on enzyme activity

3 讨论

微生物来源的蛋白酶在造纸、皮革加工、液体洗涤剂制备、食品加工和医疗等工业领域具有重要应用价值。 尤其碱性和热稳定性蛋白酶是较为重要的一类[24]。 耐高温蛋白酶具有耐热性，可广泛用于食品加工、皮革加工和洗涤剂制备等工业，已成为国内外酶研究的热点[25]。 然而，目前可用于较苛刻环境下的高温蛋白酶和菌株资源非常稀少，筛选高温蛋白酶高产菌株、优化发酵条件并获得大量蛋白酶是急需解决的问题[26]。

蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)可产生具有工业应用价值的蛋白酶，如于平等[27]筛选到一株高产新型中性蛋白酶的蜡样芽孢杆菌；刘丽莉等[28]筛选到一株胶原蛋白酶高产菌株B. cereusMBL13；杨姗等[29]筛选出一株产脱毛蛋白酶的菌株B. cereusSZ-4；但菌株B.cereusMBL13 和B. cereusSZ-4 所产蛋白酶对50℃以上的热稳定性较差[28-29]，不具备耐热性。 本研究筛选到1 株产蛋白酶菌株B. cereusHSU-2，酶活参数测定结果表明该蛋白酶最适pH 值为7.0、最适反应温度为60℃，且在最适条件下酶活力可达418.10 U·mL-1，远高于菌株B. cereusMBL13 产蛋白酶的酶活力(36.80 U·mL-1)[28]。 该蛋白酶的耐受温度为60℃，远高于菌株MBL13 所产胶原蛋白酶(最适酶活温度为40℃)能耐受的温度；且该蛋白酶的最适pH 低于菌株SZ-4 产脱毛蛋白酶的最适pH 值10.0。 同时，刘丽莉等[28]和杨姗等[29]报道Mg2+、Zn2+、Ca2+对菌株B. cereusMBL13产胶原蛋白酶和菌株B. cereusSZ-4 产脱毛蛋白酶酶活力有促进作用，Cu2+可显著抑制这些酶的活性；而本研究发现Mg2+、Zn2+、Cu2+可抑制菌株HSU-2 产蛋白酶的酶活力，Ca2+可促进其酶活力，这与以上2 种蛋白酶的特征有明显差别，表明菌株HSU-2 产蛋白酶是一种新型中性蛋白酶。 中性蛋白酶可在中性pH 下将动植物蛋白水解为小分子多肽，是酿造、食品、饲料、医药及生物降解等行业中不可或缺的酶[30]，具有潜在重要工业开发价值。

蛋白酶的最大应用领域是洗涤剂工业[1]。 研究表明日化洗涤品如洗洁精、洗衣液、洗衣粉等pH 值为7.0 ～10.2[31]。 而欧洲使用加酶洗衣粉的比列高达85%，且欧洲人习惯于在洗衣前先用40 ～60℃热水浸泡[1]。 本研究还发现，尽管菌株HSU-2 产蛋白酶最适pH 值为7.0，但在pH 值8.0～9.0 范围内其酶活仍能维持在最大酶活力的90.6%以上；尤为重要的是该蛋白酶能耐受60℃高温和5.0% SDS 的作用。 因此，菌株HSU-2 产蛋白酶也可用于洗涤产品的开发，较为适合研发用于出口欧洲地区使用的加酶洗衣粉。

4 结论

本研究利用酪素培养基筛选法筛选出一株产蛋白酶B. cereus菌株HSU-2，其产蛋白酶的最适反应pH值和温度分别是7.0 和60℃，是一种耐高温的中性蛋白酶；在最适pH 和温度下，菌株HSU-2 产蛋白酶发酵液的酶活力达418.10 U·mL-1。 该蛋白酶可耐受5.0% H2O2、5.0% SDS 和5.0% Triton X-100 作用，而5.0% Tween 80 可明显提高该蛋白酶的酶活力。Mg2+、Zn2+、K+、Ni2+和Cu2+可明显抑制该蛋白酶酶活力，而Ca2+可提高其酶活力。 本研究结果为菌株HSU-2 的工业化应用开发奠定了研究基础。