基于Au@Ag纳米颗粒的表面增强拉曼检测血浆中的法莫替丁

臧颖超，朱慧敏，范夏琼，张志敏，卢红梅

(中南大学 化学化学工学院，湖南 长沙 410083)

法莫替丁(FMD)是第三代H2受体拮抗剂，对胃酸分泌有明显的抑制作用，临床上主要用于治疗十二指肠溃疡和上消化道出血[1]。目前，法莫替丁的检测方法主要有高效液相色谱法[2-4]、气相色谱法[5]、伏安法[6]和分光光度法[7]等，其中，色谱法需昂贵的仪器设备，且前处理复杂、费时，不能实现对大量样本的快速检测；而伏安法和分光光度法虽然前处理简单，但其抗干扰能力较低。因此，有必要开发简便、快速、灵敏的法莫替丁检测方法。

表面增强拉曼光谱(SERS)因具有无损、快速、高灵敏度和高选择性等特点，广泛应用于药物[8]、生物[9]、环境[10]和食品[11]等领域，其基底是影响SERS信号增强效果的一个重要因素。银纳米粒子(AgNPs)和金纳米粒子(AuNPs)是常用的SERS基底。AgNPs具有较好的SERS活性，但不稳定，易在空气中被氧化。AuNPs虽具有良好的稳定性，但增强效果比AgNPs弱。因此，探究同时具有高SERS活性和较好稳定性的纳米材料非常必要。由于金和银具有晶格相匹配的特性，以金-银核壳纳米材料作为SERS的基底近年来受到关注[12]。与单独的AuNPs或AgNPs相比，核壳Au@Ag纳米粒子(Au@AgNPs)既保持了AgNPs良好的SERS活性，又具有AuNPs的稳定性和均匀的形貌[13]。本文通过种子生长的方法合成Au@AgNPs，并将其作为表面增强拉曼光谱的基底用于检测法莫替丁，为药物检测提供了快速、简便的新方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UV-1800紫外可见吸收光谱仪(岛津公司)；S-4800场发射电子显微镜(SEM)(日立公司)；透射JEM-1400 Plus电子显微镜(JEOL公司)；Empyrean锐影X射线衍射仪(帕纳科公司)；i-Raman便携式拉曼仪器(B & W Tek公司)；原子型1810a摩尔超纯水机(上海摩勒科学仪器有限公司)。

硝酸银、氯金酸、柠檬酸三钠和法莫替丁购自中国上海Sigma-Aldrich公司；抗坏血酸和罗丹明6G(R6G)购自上海泰坦科技有限公司；所用化学试剂均为分析纯。实验用水为自制超纯水(18.2 MΩ·cm)。

图1 Au@AgNPs的合成及对法莫替丁的检测Fig.1 Synthesis of Au@AgNPs and its detection for famotidine

1.2 Au@AgNPs的制备

通过种子介导的方法合成了Au@AgNPs[14]。AuNPs种子的合成：将125 μL(0.1 mol/L)的HAuCl4稀释至50 mL水中，加热至沸腾，搅拌并快速加入750 μL(1%)柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌30 min，获得金种子溶液。Au@AgNPs的制备：取3 mL AuNPs作为种子溶液，加入450 μL抗坏血酸溶液(0.1 mol/L)，边搅拌边逐滴加入1.35 mL AgNO3溶液(10 mmol/L)。在此过程中，可观察到溶液的颜色由酒红色变为橙色，表明金核的外层已成功地生长了一层银。Au@AgNPs的合成及对法莫替丁的检测见图1。

1.3 样品制备

标准溶液：取一定量法莫替丁标准品用水配成浓度为1×10-2mol/L的标准储备液，再逐级稀释为1×10-7～1×10-4mol/L系列浓度的法莫替丁标准溶液。

血浆样品：先用水稀释血浆以减少基质效应的干扰，然后向稀释后的血浆中加入不同浓度的法莫替丁标准溶液，配成不同浓度的法莫替丁(0.45～250 μmol/L)血浆样本。

1.4 光谱检测

将100 μL法莫替丁标准溶液与100 μL的Au@AgNPs溶液混合，取一定量混合液滴于硅胶板上，调节合适的激光和待测样表面距离以得到理想的光谱。光谱采集参数：激光波长785 nm，积分时间为30 s，物镜倍数20倍，光谱采集范围为200～4 000 cm-1。

图2 金种子(红线)和金核银壳纳米粒子(黑色)的紫外可见吸收光谱Fig.2 UV-Vis spectra of Au seeds(red line) and core-shell Au@Ag nanoparticles(black line)

2 结果与讨论

2.1 基底的表征

由AuNPs和Au@AgNPs的紫外可见吸收光谱图可见，AuNPs在525 nm处具有很强的吸收峰(图2)。当Ag在Au核上形成Ag壳，得到Au@AgNPs后，金核的吸收峰蓝移至480 nm，并在390 nm处出现了一个银壳的吸收峰。这是由于Ag和Au具有不同的等离子体共振频率，两者间发生了重叠和耦合。

采用SEM和TEM对合成的Au种子和Au@AgNPs的形貌进行了分析(图3)，由图3(A，B，D，E)可见，AuNPs和Au@AgNPs主要是以球形均匀分布。通过粒径软件分析表明Au种子的平均粒径为27.94 nm(图3C)，金核表面沉积的银壳平均厚度为8.08 nm(图3F)。

AuNPs和Au@AgNPs的XRD谱图见图4A，图中38.2°、44.3°、64.5°、77.5°和82.5°分别对应于面心立方的(111)、(200)、(220)、(311)和(222)[15]。由于金和银的晶格常数相似[16]，因此峰的位置相同，很难通过衍射峰的位置比较AuNPs和Au@AgNPs，但可看出Au@AgNPs的峰更强。经高分辨率TEM分析可得Au@AgNPs的两个相邻晶格的晶面间距为0.234 nm(图4C)，接近Ag的(111)平面晶格，且Ag纳米晶体主要沿(111)方向生长[15]。

图3 AuNPs(A、B、C)和Au@AgNPs(D、E、F)的扫描电镜、透射电镜、粒径统计Fig.3 SEM,TEM and statistical histogram of particle size of AuNPs(A,B,C) and Au@AgNPs(D,E,F)

图4 AuNPs和Au@AgNPs的XRD及TEM图Fig.4 XRD and TEM of AuNPs and Au@AgNPsA:XRD of AuNPs and Au@AgNPs;B:TEM diffraction spot of Au@AgNPs;C:high-resolution TEM image taken from the Ag shell area of core-shell Au@AgNPs

图5 Au@AgNPs(A)和法莫替丁粉末(B)的拉曼光谱及法莫替丁吸附在Au@AgNPs上的SERS光谱(C)Fig.5 Raman spectra of core-shell Au@AgNPs(A) and FMD powder(B),SERS spectrum of FMD adsorbed on the Au@AgNPs substrate(C)

2.2 法莫替丁的拉曼分析

法莫替丁、Au@AgNPs的拉曼光谱以及SRES光谱如图5所示，其特征峰的归属见表1。从图中可见，法莫替丁的拉曼特征峰主要位于547、685、739、972、1 009、1 122、1 241、1 333、1 435、1 540 cm-1处，与已有文献报道的结果一致[17]。但由于分子和基底之间的取向和作用力的不同，可看到一些峰发生红移或蓝移[18]。法莫替丁的主要特征峰归属于CN的平面弯曲振动(549 cm-1)、CH2的扭转振动(1 134 cm-1)、CS的拉伸振动和平面振动(1 325 cm-1)、CN的拉伸振动和NH2的形变振动(1 540 cm-1)。法莫替丁分子与Ag壳通过Ag-N键之间的相互作用吸附在Ag壳的表面。在入射光激发下，Au@AgNPs表现出强烈的表面等离子体共振特性，具有很强的局域电场，使得处于该电场中的法莫替丁分子的信号被增强。与常规的拉曼光谱相比，SERS光谱中1 540 cm-1处的峰信号增强显著，且受到的干扰小，因此选其为特征峰用于后续分析。

2.3 Au@AgNPs的增强因子

增强因子(EF)是评价基底的SERS性能的重要因素之一，为了测试Au@AgNPs作为基底的增强性能，以R6G为探针分子，根据公式[18]计算增强因子：EF=(ISERS×CRaman)/(IRaman×CSERS)，式中IRaman和ISERS分别为1 363 cm-1处增强前、后的拉曼强度，CRaman和CSERS为增强前、后R6G的浓度，计算得EF为6.66×105，由此可见，Au@AgNPs有较高的EF值，具有检测较低浓度法莫替丁的潜力。

表1 法莫替丁的拉曼光谱和SERS光谱中主要特征峰的归属Table 1 Band assignment of major peaks in the normal Raman spectrum and SERS spectrum of FMD

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图6 不同浓度法莫替丁的SERS光谱Fig.6 SERS spectra of FMD with different concentrations

2.4 法莫替丁的定量检测

以Au@AgNPs为基底，检测了不同浓度(0、0.4、0.5、1.0、2.5、5.0、10、25、50、100 μmol/L)的法莫替丁标准溶液，由其SERS光谱图可知，随着法莫替丁浓度的降低，1 540 cm-1处特征峰的强度也随之降低(图6)，当浓度低至0.4 μmol/L时，仍可看到明显的特征峰。由于法莫替丁中不同的官能团在基底表面的吸附和取向不同，随着法莫替丁浓度的降低，不同特征峰的强弱变化不同。法莫替丁浓度的对数(x)在0.5～50 μmol/L范围内和1 540 cm-1处峰强度的对数(y)呈现良好的线性关系，线性方程为y=4.720 5x+0.249 1，相关系数(r2)为0.978，以公式LOD=3Sb/b[19]计算检出限(LOD)，其中Sb为特征峰1 540 cm-1处空白样SERS强度的标准偏差，b为建立的校准曲线的斜率，计算得到LOD为4.18×10-8mol/L。

2.5 血浆中法莫替丁的检测

为评估本方法在实际样本中的可行性，将法莫替丁溶液加入稀释的血浆样品中，然后与Au@AgNPs混合，考察了稀释血浆中不同浓度(0、0.45、2.5、4.5、25、45、250 μmol/L)法莫替丁的SERS光谱。结果显示，空白血浆光谱中无组分干扰法莫替丁的识别，稀释血浆中法莫替丁的SERS光谱强度(1 540 cm-1)随其浓度的降低逐渐减弱，峰强度的对数(y)与对应浓度的对数(x)在0.45～250 μmol/L范围内具有良好的线性关系，线性方程为y=4.331 8x+0.218 8，r2=0.975，计算得LOD(3Sb/b)为1.11×10-7mol/L。由此可见，制备的Au@AgNPs可用于血浆中法莫替丁的快速检测。

2.6 回收率及相对标准偏差

向血浆中加入一定量法莫替丁考察方法的准确性，加标浓度为2.5、25、250 μmol/L，每个浓度平行实验3次，在优化条件下测定。计算得3个加标浓度下法莫替丁的回收率为91.6%～122%，相对标准偏差(RSD)为6.6%～12%，方法准确可靠，可满足血浆中法莫替丁的测定要求。

2.7 Au@AgNPs重现性及选择性

SERS信号的重现性是评价基底性能和SERS方法实际应用的一个因素，实验随机检测了12批次法莫替丁，计算得其在1 540 cm-1处强度的RSD为9.5%，表明Au@AgNPs作为SERS基底检测法莫替丁具有良好的重现性[15]，可用于实际样品检测。

3 结 论

本文建立了以Au@AgNPs为SERS基底的快速灵敏检测法莫替丁的方法。结果表明，以Au@AgNPs检测法莫替丁标准溶液，方法在0.5～50 μmol/L范围内具有较好的线性关系，r2为0.978，LOD为4.18×10-8mol/L。使用Au@AgNPs对稀释血浆中的法莫替丁进行SERS检测，线性范围为0.45～250 μmol/L，r2为 0.975,LOD为1.11×10-7mol/L,加标回收率为91.6%～122%。所建立的方法可用于生物样品中法莫替丁的快速灵敏检测。