苯并[a]芘和1-羟基芘诱导人胚胎干细胞分化心肌细胞ROS、CYP基因表达和DNA损伤

吴彬彬，晏斌，胡梅，陈曦,5，梁岩

1. 中国科学院深圳先进技术研究院，深圳 518055 2. 中国科学院大学，北京 100049 3. 香港大学李嘉诚医学院，香港 4. 山东省食品药品检验研究院，济南 250101 5. 电子科技大学资源与环境学院，成都 611731

多环芳烃(PAHs)是有机物未充分燃烧产生的化合物，其主要来源有化石燃料、森林火灾和火山爆发等。PAHs是重要的环境和食品污染物，暴露于PAHs能增加基因突变以及患癌症和心血管疾病的风险[1-2]。在已知的150余种PAHs中，苯并[a]芘作为高环PAH，长期以来被认为可诱导活性氧(ROS)、突变并具有致癌作用。此外，越来越多的证据表明，苯并[a]芘暴露与心脏疾病密切相关[1,3-4]，可导致心脏肥大、心脏发育缺陷和致命性缺血性心脏病等。苯并[a]芘可以吸附在大气细微颗粒表面，也可以在抽烟或食物烧烤过程中产生，苯并[a]芘被人体摄入或吸入后，可与芳烃受体(AhR)结合，导致AhR转移至细胞核，诱发下游基因(例如CYP1A1)的转录和表达，促使与突变密切相关的二氢二醇环氧苯并[a]芘(benzo[a]pyrene-7,8dihydrodiol-9,10-epoxide, BPDE)-DNA加合物的形成，而一旦心脏的关键DNA序列发生突变，就会产生灾难性的后果[5-6]。

为了评估PAHs的暴露水平，尿液1-羟基芘已被广泛用作PAHs暴露的标志物[7-9]。1-羟基芘是由CYP1A1催化的芘的代谢物，在尿液中排出。据报道，PAHs职业暴露后，1-羟基芘浓度与心脏自主神经功能障碍有关[2]。然而，目前关于阐释苯并[a]芘和1-羟基芘对心脏疾病影响的研究鲜有报道。到目前为止，苯并[a]芘和1-羟基芘诱发人类心脏病的机制尚不清楚，而部分原因是由于缺少基于人源心肌细胞的研究模型。近年来，作为一种新兴的心肌细胞模型，人胚胎干细胞分化心肌细胞(hESC-CM)引起了广泛的关注，它为药物检测、心脏发育、功能和病理生理学研究提供了一个相对便宜和方便的研究载体[10]。hESC-CM能够通过干细胞培养和分化持续获得，且与其他动物细胞相比，对人类而言没有物属差异。因此，hESC-CM越来越多地被用于心脏疾病的研究中。

基于以上信息，本研究将通过分析苯并[a]芘和1-羟基芘暴露后hESC-CM的ROS、CYP基因表达和DNA损伤，探讨苯并[a]芘和1-羟基芘对心脏可能的毒性机制。

1 材料与方法 (Materials and methods)

1.1 实验材料

H7细胞购于WiCell研究所(WiCell Research Institute, Inc.，美国)，E8培养基、RPMI 1640培养基、DMEM/F12培养基、B27+supplement、Geltrex和PrestoBlue试剂购于美国Life Technology公司，MatriGel购于美国B&D公司，Y27632(纯度≥99%)购于美国R&D公司，CHIR 99021(纯度99.2%)购于美国Selleck Chemicals公司。OxiSelectTMcomet asssay试剂盒购于美国Cell Biolabs公司，CYP1A1抗体购于英国Abcam公司，BPDE-DNA抗体(5D11)购于美国Santa Cruz Biotechnology公司，IWR-1(纯度≥98%)、苯并[a]芘(纯度≥96%)和1-羟基芘(纯度98%)购于美国Sigma公司，6孔和96孔板购于美国康宁公司。PrimeScrip RT试剂盒购于日本TAKARA公司，活性氧检测试剂盒购于碧云天生物技术研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和心肌细胞分化

使用E8培养基培养人胚胎干细胞系(H7细胞)。将未分化的H7细胞以每孔1×105个细胞接种在Matrigel包被的6孔板上直至80%～90%汇合，然后在第0天加入6 μmol·L-1CHIR 99021。从第2天开始，更换为RPMI/B27培养基，然后在第3天加入10 μmol·L-1IWR-1并在第5天更换RPMI/B27培养基一次。将hESC-CM维持在RPMI/B27+培养基中培养。细胞培养28 d后，进行后续实验。

1.2.2 细胞活力测定

使用二甲基亚砜(DMSO)溶解苯并[a]芘和1-羟基芘，并倍数稀释成200～6.25 μmol·L-1系列浓度。将稀释后的苯并[a]芘和1-羟基芘溶液加入到Geltrex预包被的含有hESC-CM的96孔培养板上，0.1% DMSO作为对照组。24 h后，将PrestoBlue试剂加入各孔，37 ℃和5% CO2条件下孵育30 min，使用ELx800Biotek酶标仪及Gene5软件(Biotek, USA)检测细胞荧光值。

1.2.3 ROS检测

接种在Geltrex预包被培养板上的hESC-CM经系列浓度的苯并[a]芘或1-羟基芘处理24 h后，培养基更换为含有10 μmol·L-1DCFH-DA(上海碧云天生物技术有限公司)的RPMI/B27+培养基，37 ℃细胞培养箱内孵育20 min，1×D-PBS(杜氏磷酸盐缓冲液，不含Ca2+和Mg2+)洗涤2次，使用荧光显微镜(Eclipse 800, Nikon，日本)拍照，使用Image J软件进行数据分析。

1.2.4 RNA提取和qPCR分析

使用50 μmol·L-1苯并[a]芘或1-羟基芘处理48 h后，使用Trizol试剂(Invitrogen，美国)提取hESC-CM总RNA，使用PrimeScrip RT试剂盒合成cDNA。目的基因在StepOnePlusTM(Applied Biosystem，美国)平台上用SYBR®PremixEx TaqTM进行扩增，qPCR条件为95 ℃、3 min预变性，35个循环，具体为95 ℃、15 s，60 ℃、30 s。采用GAPDH作为内参。PCR引物序列如表1所示。

1.2.5 免疫荧光实验

使用50 μmol·L-1苯并[a]芘或1-羟基芘处理48 h后，使用预冷的D-PBS洗涤2次，然后用4%多聚甲醛固定15 min，D-PBS洗涤3次，室温下用含10%胎牛血清的封闭缓冲液孵育1 h。CYP1A1抗体或BPDE-DNA抗体4 ℃孵育过夜，然后D-PBS洗3次后，二抗室温下孵育1 h。最后再用D-PBS洗3次，用荧光显微镜(Eclipse 800, Nikon，日本)拍照，Image J软件进行数据分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.6 彗星试验

为了检测50 μmol·L-1苯并[a]芘或1-羟基芘诱导的DNA损伤，使用OxiSelectTMcomet asssay试剂盒进行碱性彗星试验。细胞处理48 h后，D-PBS洗涤，塑料刮收集细胞，然后将细胞转移到1.5 mL EP管中，700 g离心2 min，预冷的D-PBS洗2次。然后调整细胞数量为1×105个·L-1。将细胞与琼脂(V/V=1∶10)混合，以75 μL每孔涂到载玻片上，4 ℃下放置15 min，然后将载玻片转移到预冷的裂解缓冲液中裂解1 h，再置于预冷碱性溶液30 min。最后，使用碱性电泳液电泳30 min，并进行DNA染色。使用荧光显微镜(Eclipse 800, Nikon，日本)对细胞进行拍照，使用Image J进行数据分析。

1.2.7 统计分析

采用Image J 1.52a软件进行荧光强度分析，采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)，数据以平均值±SD表示，P<0.05为具有统计学差异。

2 结果(Results)

2.1 细胞活力检测

作为国际癌症研究机构确定的一种致癌PAHs，已有多项研究报道苯并[a]芘能降低细胞活力(表2)。根据细胞培养条件、处理时间和细胞种类的差异，苯并[a]芘抑制细胞活力的浓度范围为1～50 μmol·L-1(表2)。然而，Sirenko等[11]通过钙黄绿素-乙酰甲酯(Calcein-AM)信号检测发现，低浓度的苯并[a]芘(1 μmol·L-1)能增加hiPSC-CM细胞活力，而高浓度(10 μmol·L-1)时则降低细胞活力；An等[12]研究发现，苯并[a]芘对LO2细胞活力没有影响。因此，苯并[a]芘对不同细胞毒性可能存在不同。作为具有非增殖特征的新型细胞模型，苯并[a]芘处理hESC-CM后，并未改变其细胞活力。此外，1-羟基芘对hESC-CM的活力也没有显著影响。

2.2 苯并[a]芘和1-羟基芘诱导ROS的产生

通过DCFH-DA检测了苯并[a]芘和1-羟基芘处理后hESC-CM内的ROS水平。处理48 h后，50 μmol·L-1的高浓度1-羟基芘能够显著诱导hESC-CM内ROS的产生，但低浓度1-羟基芘(5和25 μmol·L-1)对ROS的产生无显著影响(图1(a))。但对于苯并[a]芘，hESC-CM内的ROS水平呈现明显的剂量-反应关系(图1(b))，这与已有报道结果相一致[15,18]。10 μmol·L-1的苯并[a]芘能显著增加hESC-CM内的ROS水平，表明对于hESC-CM，苯并[a]芘诱导ROS的能力强于1-羟基芘。

图1 在hESC-CM中1-羟基芘(a)和苯并[a]芘(b)诱导活性氧(ROS)的生成水平注：DMSO表示二甲基亚砜，*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 1 The reacitve oxygen species (ROS) production induced by 1-hydroxypyrene (a) and benzo[a]pyrene (b) in hESC-CMNote: DMSO stands for dimethyl sulfoxide, *represents P<0.05, **represents P<0.01.

表2 苯并[a]芘对细胞活性的影响Table 2 The cell activity under benzo[a]pyrene treatment

注：Calcein-AM表示钙黄绿素-乙酰甲酯，MTT表示3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，XTT表示2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺酸苯基)-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-氢氧化四唑，PrestoBlue表示基于刃天青的即用型溶液；#，与对照组相比，细胞活力有统计学差异(P<0.05)；*，50%抑制效应浓度(IC50)；&，单位为μg·mL-1。

Note: Calcein-AM stands for Calcein acetoxymethyl ester; MTT stands for 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide; XTT stands for 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide; PrestoBlue is a ready to use cell permeable resazurin-based solution; #, compared with the control group, there were statistically significant differences in cell activity; *, 50% inhibitory concentration (IC50); &, the unit is μg·mL-1.

2.3 线粒体凋亡基因的表达

Bcl-2、bad和bax是细胞内重要的凋亡相关基因，在线粒体凋亡中发挥重要作用。苯并[a]芘作用hESC-CM后，诱导了bad的表达(P=0.05)(图2(a))，表明苯并[a]芘能够诱导hESC-CM凋亡，这与已有研究报道相符[19]。1-羟基芘处理hESC-CM后，Bcl-2和bad的表达都略有增加，但均无统计学差异(图2(b))。1-羟基芘是芘的代谢物，而已有研究表明，芘是一种能刺激ROS产生的PAH[20-21]。1-羟基芘处理对hESC-CM线粒体凋亡基因的表达无显著影响，提示催化芘转化为1-羟基芘的关键酶——细胞色素P450(CYP450)酶可能发挥了重要作用[22-23]，其可能催化芘转化为1-羟基芘，降低了细胞的ROS水平，而ROS是线粒体凋亡基因表达的重要诱因之一。

图2 苯并[a]芘(a)和1-羟基芘(b)诱导hESC-CM线粒体凋亡相关基因表达Fig. 2 hESC-CM apoptosis-related gene expression induced by benzo[a]pyrene (a) and 1-hydroxypyrene (b)

2.4 CYP基因及蛋白表达水平

苯并[a]芘处理细胞48 h后，CYP1A1的表达量与对照相比显著增加(图3(a))。此外，尽管没有统计学差异，但1-羟基芘暴露也增加了hESC-CM的CYP1A1表达量(P>0.05，图3(b))。进一步通过免疫荧光实验检测了CYP1A1蛋白的表达水平，结果表明，苯并[a]芘和1-羟基芘处理均能增加CYP1A1蛋白的表达(图3(c)和(d))，与基因表达的结果相一致。

2.5 DNA加合物检测

为了进一步分析苯并[a]芘和1-羟基芘对hESC-CM的毒性作用，通过免疫荧光检测了细胞DNA加合物水平。结果表明，苯并[a]芘可以显著诱导hESC-CM DNA加合物的产生(图4(a))。而作为PAHs在体内代谢的产物和人体PAHs暴露的检测标志物，1-羟基芘暴露也能导致hESC-CM DNA加合物的增加(图4(b))，提示1-羟基芘也存在诱导心肌细胞损伤的风险。

2.6 DNA损伤检测

分析了苯并[a]芘和1-羟基芘作用于hESC-CM后细胞DNA的损伤情况，结果如图5所示。与对照组相比，50 μmol·L-1苯并[a]芘增加了hESC-CM的DNA损伤水平(P=0.05)。此外，虽然1-羟基芘没有显著诱导DNA损伤，但它具有增加hESC-CM DNA损伤的趋势(P=0.06)。

3 讨论(Discussion)

在心脏内，ROS参与多种细胞信号传导途径，并在许多生物学过程中发挥重要作用。苯并[a]芘诱导细胞ROS的产生已被广泛报道[12,14]，但苯并[a]芘和1-羟基芘是否诱导hESC-CM产生ROS尚不清楚。目前，仅有少量研究报道，1-羟基芘与急性心肌梗死氧化应激有关[24]。心肌细胞长期暴露于ROS会导致心律失常，缺血再灌注损伤，并通过诱导心脏肥大、坏死和纤维化导致心脏重塑[25-26]。此外，作为一种主要在线粒体中产生的自由基[25]，ROS能够通过促进线粒体凋亡基因和p53蛋白的表达来诱导心肌细胞的凋亡[26-27]，因此，苯并[a]芘诱导hESC-CM线粒体凋亡基因bad的表达与ROS密切相关。

人体暴露于PAHs后，PAHs会被人体内的代谢酶所代谢。其中，CYP家族的主要功能是对内源性和外源性化合物进行转化[23]。目前，在哺乳动物CYP家族中已发现了几种参与PAHs代谢的基因。在这些基因中，CYP1A1在苯并[a]芘的代谢中发挥重要作用。CYP1A1在细胞和组织中普遍表达[28]，当细胞暴露于PAHs后会诱导CYP1A1的表达(图3)。通常，CYP1A1催化苯并[a]芘转化为苯并[a]芘-7,8-环氧化物，其能迅速代谢为苯并[a]芘-7,8-二氢二醇，然后被CYP1A1进一步活化产生苯并[a]芘-7,8-二氢二醇-9,10-环氧化物(BPDE)，PAHs的毒性主要反映在体内氧化酶的代谢产物中。由PAHs产生的代谢物可以进一步与DNA反应，形成BPDE-DNA加合物(图4)，导致基因DNA序列中G到T的碱基突变[29]，促进细胞突变和DNA损伤(图5)。心肌细胞DNA损伤的积累能诱导DNA损伤反应的持续激活[30]，导致炎性细胞因子的表达增加，进而引发压力超负荷引起的心力衰竭的发生发展[31]。此外，DNA损伤还与细胞衰老密切相关，心肌细胞衰老能促进心血管疾病的发生[32]，在衰老和心力衰竭中已观察到异常的心肌变化[32-33]。

图3 苯并[a]芘和1-羟基芘诱导hESC-CM CYP1A1基因和蛋白的表达注：(a)和(b)为苯并[a]芘和1-羟基芘处理后基因的表达，(c)和(d)为苯并[a]芘和1-羟基芘处理后蛋白的表达；*表示P<0.05。Fig. 3 The gene and protein expression of CYP1A1 in hESC-CM induced by benzo[a]pyrene and 1-hydroxypyreneNote: (a) and (b), gene expression after benzo[a]pyrene and 1-hydroxypyrene treatment; (c) and (d), protein expression after benzo[a]pyrene and 1-hydroxypyrene treatment; *represents P<0.05.

图4 苯并[a]芘(a)和1-羟基芘(b)诱导DNA加合物的产生注：*表示P<0.05。Fig. 4 DNA adducts induced by benzo[a]pyrene (a) and 1-hydroxypyrene (b) Note: *represents P<0.05.

图5 苯并[a]芘(a)和1-羟基芘(b)诱导hESC-CM DNA损伤Fig. 5 DNA damage of hESC-CM induced by benzo[a]pyrene (a) and 1-hydroxypyrene (b) respectively

总之，PAHs与心脏疾病密切相关，本研究基于hESC-CM模型研究了PAHs典型代表性物质苯并[a]芘和人体暴露后检测标志物1-羟基芘的心肌细胞毒性。结果表明，苯并[a]芘和1-羟基芘能导致hESC-CM细胞的氧化应激和DNA损伤。据笔者所知，目前尚未有基于hESC-CM的苯并[a]芘和1-羟基芘导致心肌细胞损伤的报道。因此，本研究在体外实验中首次直接证明了苯并[a]芘和1-羟基芘可以诱导人干细胞源心脏细胞损伤，这为PAHs暴露与心脏功能障碍关系的进一步研究夯实了理论基础。

致谢：感谢香港大学Kenneth R. Boheler教授、Ellen Ngar-yun Poon助理教授及博士研究生Stanley Chun-ming Wu在实验中给予的帮助。