磁铁矿纳米颗粒与Pb2+复合物对大鼠肾细胞的毒性研究

陈力可，郭昌胜，刘淼，李专，徐建,*

1. 中国环境科学研究院，环境健康风险评估与研究中心，北京 100012 2. 吉林大学新能源与环境学院，长春 130012 3. 吉林省环境监测中心站，长春 130011

随着现代社会工业的快速发展，水体污染日益严重，已经成为威胁和制约人类健康和发展的重要因素。铅(Pb)是一种重金属元素，也是水环境中持久性污染物，会对水生态环境和人类健康产生广泛和严重的危害[1]。有研究指出，在环境浓度水平的Pb2+(0.02 μg·mL-1)溶液中暴露96 h即可导致斑马鱼的胚胎毒性及行为异常[2]。Pb2+暴露也会严重影响生物体的神经系统、免疫系统、肾脏以及造血系统等，而肾脏是Pb2+在生物体中的主要排泄器官，也是Pb2+的主要靶器官[1,3]。Pb2+对细胞的毒性作用机制目前还不完全清楚，相关研究表明，目前主要的作用机制包括导致细胞活性降低、导致细胞线粒体损伤和诱导细胞凋亡等方式[4]。

近年来，磁铁矿纳米颗粒(magnetite nanoparticles, MNPs)作为一种新型材料越来越受到研究者的广泛关注，MNPs比表面积大、反应活性高，且具有简单易回收等特点，目前被广泛用于水中重金属元素Pb处理[5]。一项研究表明，海泡石和Fe3O4纳米复合材料对水中Pb2+的吸附容量达到96.15 mg·g-1，效果远高出同类吸附剂，而且成本低廉[6]。因此，这种高效、经济的方法在污水治理行业中已被迅速地产业化。

虽然MNPs应用范围十分广泛，但是关于MNPs处理金属后形成的复合物对生物和环境的毒性研究却很有限。而MNPs在生产、使用以及废弃的过程中将不可避免地进入水生环境[5]，MNPs相对于大颗粒物具有更大的比表面积，一旦进入环境中，可显著影响环境中污染物的环境行为，或导致污染物生物有效性和毒性效应的改变，从而引发多种生物学效应。污染物之间的相互作用可分为加和作用、协同作用和拮抗作用[7]。例如，全氟辛烷磺酸钾(PFOS)和纳米氧化锌单独与复合暴露均可造成斑马鱼胚胎的氧化损伤和细胞凋亡，但复合暴露组的氧化损伤和细胞凋亡程度明显大于单独暴露组，表现出协同作用[8]。姜文博等[9]研究发现，单独的纳米二氧化钛可剂量依赖性地引起心肌细胞DNA损伤，而叔丁基对苯二酚(tertbutylhydroquinone, tBHQ)与纳米二氧化钛联合暴露可降低纳米二氧化钛导致的心肌细胞DNA损伤，表现出拮抗作用。协同或拮抗作用会直接或间接地增强或抑制污染物的毒性，因此，研究纳米颗粒与污染物复合物的生物毒性效应，对于评价其生物安全性及环境风险具有十分重要的意义。目前，MNPs和Pb2+的毒性研究多限于单一MNPs或Pb2+在实验室条件下的毒性效应分析，虽然研究发现MNPs对生物体是相对无毒或低毒性的[5,10]，但是MNPs-Pb复合物对细胞和机体的毒性却鲜有报道，其复合毒性亟待深入研究。

本研究在对MNPs、MNPs-Pb以及培养基等性质进行表征的基础上，选取大鼠肾细胞作为毒性评价的细胞模型，研究不同Pb含量的MNPs-Pb，以及作为对比的相应浓度的MNPs和Pb2+，对细胞活性、细胞形态和密度、细胞对纳米颗粒的摄取以及细胞凋亡的影响，并对MNPs-Pb潜在的毒性效应进行评估。研究结果可为MNPs与重金属复合物对环境的影响及生物安全性评估提供一定的实验依据和参考价值。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 主要仪器和实验材料

MNPs为吉林大学新能源与环境学院提供，合成方法为共沉淀法[5]，纳米颗粒为规则的球状结构，单分散性较好，粒径为20～25 nm，经过X射线衍射仪分析，其衍射峰与Fe3O4标准卡JCPDS 79-0491匹配良好，表明成分为Fe3O4。实验中MNPs所用分散剂为纯水。Pb2+标准溶液(1 000 mg·L-1)购自国家标准物质中心。

肾脏是Pb2+毒性作用的主要靶器官之一[3]。大鼠肾细胞是研究Pb2+毒性的常用的体外实验模型细胞[1,3]，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

主要材料如下：胎牛血清(BR级，购于Gibco公司)，磷酸盐缓冲溶液(PBS) (BR级，购于Gibco公司)，Trypsin-EDTA细胞消化液(BR级，购于Gibco公司)，DMEM培养基(BR级，购于Gibco公司)，ApopNexin Annexin V FITC细胞凋亡检测试剂盒(BC级，购于Merck Millipore公司)，WST-1细胞活性检测试剂盒(BC，购于上海碧云天生物技术有限公司)，戊二醛(BC级购于BASF公司)，柠檬酸铅(GR级，购于中国国药集团)和四氧化锇(GR级，购于中国国药集团)。

主要仪器及设备如下：微孔板分光光度计(Epoch，Bio Tek，美国)，多维全景流式细胞仪(Merck FlowSight IS100，Millipore，德国)，透射电子显微镜(TEM)(H-8100，Hitachi，日本)，倒置相差显微镜(Axio Vert.A1，Zeiss，加拿大)，CO2恒温培养箱(MIR-254-PC，Sanyo，日本)，低温高速离心机(3K15，Sigma，德国)，电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES)(Optima 8000，PE，美国)，扫描电子显微镜(SEM)(JSM-6700F，JEOL，日本)，恒温培养摇床(THZ-300，上海一恒科技，中国)，动态光散射粒度仪(Zetasizer Nano ZS，Malvern，英国)。

大鼠细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每2～3天传代一次。取对数生长期细胞，用Trypsin-EDTA细胞消化液消化。取适量复合物MNPs-Pb或MNPs或Pb2+加入DMEM中，分别得到浓度为150 μg·mL-1MNPs-1 μg·mL-1Pb(记作MNPs-1 μg·mL-1Pb)、150 μg·mL-1MNPs-3 μg·mL-1Pb (记作MNPs-3 μg·mL-1Pb)、150 μg·mL-1MNPs-5 μg·mL-1Pb(记作MNPs-5 μg·mL-1Pb)；以及150 μg·mL-1MNPs、1 μg·mL-1Pb2+、3 μg·mL-1Pb2+和5 μg·mL-1Pb2+的培养基。分别将细胞暴露于以上浓度MNPs-Pb、Pb2+和MNPs培养基中12 h。

1.2 MNPs与Pb2+复合物的制备及表征

按照相关文献，在适当pH值的水溶液中进行MNPs对Pb2+的吸附实验，用Langmuir模型计算MNPs对Pb2+吸附容量[6,11]。在确定MNPs对Pb2+吸附容量后，称取多份1.2 g MNPs粉末，分别加入pH值为6的200 mL的40、120和200 μg·mL-1的Pb2+溶液中，37 ℃下震荡24 h后，磁分离，用去离子水将分离后复合物清洗2遍后，冷冻干燥。制得MNPs与Pb2+的复合物MNPs-Pb：MNPs(150 mg)-Pb(1 mg)、MNPs(50 mg)-Pb(1 mg)、MNPs(30 mg)-Pb(1 mg)(上述MNPs-Pb的含量，只表示复合物中MNPs和Pb的质量比例，并不代表绝对质量)。最后将适量MNPs和MNPs-Pb超声分散于DMEM培养基中，用动态光散射粒度仪(DLS)测定纳米颗粒的水合粒径。

1.3 TEM表征

取经过不同浓度MNPs、MNPs-Pb和Pb2+作用12 h后的细胞及对照组细胞，按如下方法操作：(1)用PBS清洗细胞2遍；(2)倾去PBS，加入4 ℃的2.5%戊二醛溶液，固定15 min；(3)用细胞刮铲轻轻将细胞从6孔板中刮下，收集细胞于1.5 mL离心管内，以3 000 r·min-1速度离心15 min，倾去上清液，并用PBS洗涤细胞沉淀1次。然后将细胞沉淀再次离心，对细胞沉淀进行固定、脱水、包埋和切片，用透射电镜观察细胞对纳米颗粒的摄取[12]。

1.4 细胞活性检测

取对数生长期贴壁培养大鼠肾细胞，分别添加不同浓度梯度的MNPs、MNPs-Pb和Pb2+的DMEM培养基，并设置对照组，放入37 ℃培养箱培养12 h。用WST-1法对细胞活性进行检测，使用微孔板分光光度计在波长450 nm处测定各样品及对照组的吸光度A450，计算细胞活性[13]。

1.5 细胞形态的光学显微镜观察

取对数生长期的大鼠肾细胞，分别经过消化、离心后接种于6孔培养板，置于培养箱孵育12 h。取出6孔培养板，倾去原有培养基，分别加入2 mL含有不同浓度MNPs、MNPs-Pb和Pb2+的DMEM培养基，置于恒温培养箱中培养12 h后，于倒置相差显微镜下观察细胞形态和密度的改变[14]。

1.6 细胞凋亡的检测

取6孔培养板中培养的经过不同浓度MNPs、MNPs-Pb和Pb2+作用12 h后的细胞及对照组细胞。将细胞用AnnexinV FITC/PI染色法染色，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况：在收集各样品细胞数一致的条件下(每个样品约8 500个细胞)，分别在525 nm和405 nm的激发波长处采集AnnexinV FITC和PI的荧光强度，将样品细胞分为早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞、正常活细胞和坏死细胞4类[15]。统计各类型细胞百分比，定量分析细胞凋亡水平。

通过明场(bright field)和荧光染色通道观察细胞形态和染色的变化，对MNPs-Pb和Pb2+组细胞凋亡程度进行定性比较分析。

1.7 数据处理

纳米颗粒综合性质表征、细胞活性、细胞凋亡水平分析均来自3个平行样品，每个平行样品均重复测定4次，计算标准偏差，并采用SPSS 18.0软件对不同处理结果进行方差分析，设定P<0.05为具有显著性差异，P>0.05为不具有显著性差异。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 纳米颗粒及培养基的综合性质表征

纳米颗粒及培养液的综合性质表征如表1所示。

为了避免添加Pb2+、MNPs和MNPs-Pb引起的培养基pH值变化影响到细胞的正常生长以及MNPs对Pb2+的吸附，用pH计对添加Pb2+、MNPs和MNPs-Pb的DMEM培养基的pH值进行检测，结果如表1所示。由表1可知，添加MNPs和MNPs-Pb的培养基pH值接近中性，与空白DMEM比较，pH值没有显著改变；虽然加入不同浓度Pb2+的DMEM的pH值略有下降，这是因为Pb2+标准溶液为酸性，而pH值仍然接近中性。因此可知，通过培养液中缓冲液的调节，添加MNPs、MNPs-Pb和Pb2+的DMEM的pH值略微改变，不会对细胞生理功能有显著影响。相关研究表明，pH值的上升有利于MNPs对Pb2+吸附容量的增加，因为较高的pH值有利于吸附剂表面的去质子化，导致负电荷点的增加，增强了吸附剂表面与Pb2+之间的引力，从而提高了吸附容量[11]。在pH值较低的区域，正电荷中心占主导地位，这增强了吸附剂表面与Pb2+之间存在的斥力，从而降低了MNPs对Pb2+的吸附容量。Nassar等[11]研究发现，在pH值≥6.5范围内，不利于Pb2+从MNPs-Pb上脱落。因此，本研究的pH条件不会对MNPs-Pb中Pb含量产生显著影响。

动态光散射是一种常见的胶体和悬浮体表征方法，多用于测定纳米粒子的水合粒径，水合粒径更能表征纳米颗粒在溶液中形成的团聚体实际大小[16]。因为纳米颗粒与细胞间的相互作用与其团聚程度密切相关，团聚体的大小是决定纳米颗粒能否进入细胞的关键因素[17-18]。由表1可知，MNPs-1 μg·mL-1Pb、MNPs-3 μg·mL-1Pb和MNPs-5 μg·mL-1Pb各颗粒之间的水合粒径并无显著差异，平均水合粒径为441 nm。

2.2 对细胞活性影响的分析

选择大鼠肾细胞作为受试细胞，用不同浓度的Pb2+、MNPs-Pb和MNPs作用12 h后，用WST-1法测定细胞活性，测试结果如图1所示。在相同作用时间内，MNPs-Pb组细胞的活性明显高于Pb2+组细胞的活性。具体而言，MNPs-Pb组细胞的活性在80%～90%之间，不呈现显著的剂量相关性。而Pb组细胞的活性，均显著低于对照组。只有1 μg·mL-1Pb2+处理组的细胞活性为83.2%±7.1%，与MNPs-1 μg·mL-1Pb组的细胞活性没有显著性差异，其余Pb2+各组均显著低于相应的MNPs-Pb组，且呈现剂量相关性。MNPs和MNPs-Pb组的细胞活性虽然有轻微的降低，但是各组之间没有显著性差异，也未发现与MNPs-Pb中Pb浓度有剂量相关性。细胞活性检测结果说明，MNPs-Pb复合物较稳定，没有大量有毒Pb2+溶出，同时可以推测，MNPs和MNPs-Pb对细胞毒性很小。

2.3 细胞形态变化分析

分别用浓度为1、3和5 μg·mL-1的Pb2+和MNPs-1 μg·mL-1Pb、MNPs-3 μg·mL-1Pb和MNPs-5 μg·mL-1Pb作用大鼠肾细胞12 h后，采用倒置相差显微镜观察细胞形态及细胞密度变化，结果如图2所示。

表1 加入MNPs、MNPs-Pb和Pb2+的DMEM培养基的综合性质表征Table 1 Comprehensive property of culture medium (DMEM) with MNPs, MNPs-Pb and Pb2+

注：MNPs表示磁铁矿纳米颗粒，所有MNPs处理浓度均为150 μg·mL-1。

Note: MNPs stand for magnetite nanoparticles, and the MNPs concentration in all its treatments is 150 μg·mL-1.

图1 对照组、Pb2+、MNPs和MNPs-Pb各处理组的细胞活性注：a为对照组，b为1 μg·mL-1 Pb2+组，c为3 μg·mL-1 Pb2+组，d为5 μg·mL-1 Pb2+组，e为MNPs组，f为MNPs-1 μg·mL-1 Pb组，g为MNPs-3 μg·mL-1 Pb组，h为MNPs-5 μg·mL-1 Pb组；*和#分别表示各处理组与对照组、MNPs-Pb组与相应浓度Pb2+组比较具有显著性差异(P<0.05)。Fig. 1 Viability of control cells and cells treated with Pb2+, MNPs and MNPs-PbNote: a. Control group, b. 1 μg·mL-1 Pb2+ group, c. 3 μg·mL-1 Pb2+ group, d. 5 μg·mL-1 Pb2+ group, e. MNPs group, f. MNPs-1 μg·mL-1 Pb group, g. MNPs-3 μg·mL-1 Pb group, h. MNPs-5 μg·mL-1 Pb group; significant differences (P<0.05) are indicated by *when comparing treatment group with control group, by # when comparing the MNPs-Pb groups with the corresponding Pb2+ groups without MNPs.

由图2可知，对照组细胞(图2(b))生长状态良好，呈规则的多边形，贴壁生长；细胞形态饱满，胞质清亮，细胞边界清晰；细胞排列整齐，大小均一，且细胞间隙较小，细胞密度较大。

1 μg·mL-1Pb2+组细胞(图2(d))与对照组比较，形态改变不明显，随着Pb2+作用剂量的增加，Pb2+组细胞(图2(d)、图2(f)和图2(h))形态改变逐渐明显；可见贴壁细胞数目不断减少、变小和变圆，而悬浮细胞数目不断增加，且细胞排列杂乱、形状不规则、折光性差，细胞连接被破坏、间隙增大。

MNPs组(图2(a))和MNPs-Pb组细胞(图2(c)、图2(e)和图2(g))，细胞形态饱满、胞质清亮、细胞间隙较小，与对照组比较，没有明显变化。MNPs-Pb组细胞与相应浓度Pb2+组细胞比较，发现只有1 μg·mL-1Pb2+组细胞(图2(d))和MNPs-1 μg·mL-1Pb组细胞(图2(c))形态没有明显差异，其余各组形态均差异明显。以上结果表明，在本实验浓度和时间范围内，Pb2+对细胞毒性作用更强，未发现MNPs和MNPs-Pb具有强烈毒性而导致大鼠肾细胞形态和密度的显著改变。

2.4 细胞对纳米颗粒的摄取分析

细胞对纳米颗粒的摄取，受到纳米颗粒浓度和粒径大小、细胞的种类和数量等因素的影响，而纳米颗粒的大小被普遍认为是决定细胞摄取纳米颗粒的主要因素[17-18]。本研究中，细胞种类相同、数量一致且纳米颗粒浓度相等，只需比较纳米颗粒水合粒径大小。由于MNPs-1 μg·mL-1Pb、MNPs-3 μg·mL-1Pb和MNPs-5 μg·mL-1Pb之间的水合粒径没有显著差异，细胞对3种纳米颗粒的摄取难易程度一致。选取MNPs-5 μg·mL-1Pb和MNPs作用12 h后的细胞，通过TEM观察，研究细胞对MNPs-Pb和MNPs的摄取，结果如图3所示。

观察中只发现少量细胞摄取了MNPs和MNPs-Pb，图3(a)和图3(b)中可分别观察到在细胞质和内吞囊泡中的MNPs和MNPs-Pb。

2.5 对细胞凋亡的影响分析

为了确定细胞凋亡水平，实验对细胞采用AnnexinV-FITC/PI荧光染色法，并用流式细胞仪来检测细胞凋亡情况。在总细胞数一致的条件下，对各组细胞的凋亡早期、凋亡晚期细胞百分比含量进行了统计和分析，研究MNPs、Pb2+和MNPs-Pb对大鼠肾细胞凋亡水平的影响。细胞早、晚期凋亡水平如表2和表3所示。

图3 细胞的TEM图注：(a) MNPs组，(b) MNPs-5 μg·mL-1 Pb组。Fig. 3 TEM images of cellsNote: (a) MNPs group, (b) MNPs-5 μg·mL-1 Pb group.

表2 MNPs、MNPs-Pb和Pb2+对细胞早期凋亡水平的影响Table 2 Early apoptosis level of cells treated with MNPs, MNPs-Pb and Pb2+

注：*为与对照组比较有显著性差异(P<0.05)；#为MNPs-Pb组与相应浓度Pb2+组比较有显著性差异(P<0.05)。

Note: Significant differences (P<0.05) are indicated by *when comparing treatment group with control group, by#when comparing the MNPs-Pb groups with the corresponding Pb2+groups without MNPs.

表3 MNPs、MNPs-Pb和Pb2+对细胞晚期凋亡水平的影响Table 3 Late apoptosis level of cells treated with MNPs, MNPs-Pb and Pb2+

注：*为与对照组比较有显著性差异(P<0.05)；#为MNPs-Pb组与相应浓度Pb2+组比较有显著性差异(P<0.05)。

Note: Significant differences (P<0.05) are indicated by *when comparing treatment group with control group, by#when comparing the MNPs-Pb groups with the corresponding Pb2+groups without MNPs.

由表2和表3可知，经过不同浓度Pb2+作用12 h后的大鼠肾细胞，与对照组比较，细胞凋亡水平均有显著升高。具体而言，1 μg·mL-1Pb2+仅导致细胞早期凋亡水平的升高，随着剂量的增加，细胞早、晚期凋亡水平均显著增加，显示出剂量相关性，说明Pb2+浓度的增加促进了大鼠肾细胞的凋亡。MNPs组细胞，早、晚期凋亡水平与对照组比较略有增加，未发现凋亡水平有显著性差异。而MNPs-Pb组与对照组比较，早、晚期凋亡水平有一定程度的增加，只有早期凋亡水平有显著性差异，与相应浓度Pb2+组比较，凋亡水平明显降低。

MNPs-Pb组(图4(d)、图4(e)和图4(f))与相应浓度Pb2+组(图4(a)、图4(b)和图4(c))的凋亡细胞荧光染色形态结果如图4所示。通过明场通道观察，Pb2+组与MNPs-Pb组比较，凋亡早期细胞质膜皱缩变小更严重，形态改变更明显，凋亡细胞形态变化更显著。而通过荧光通道观察，分别比较Pb2+组与MNPs-Pb组的凋亡早期和凋亡晚期的细胞，Annexin V-FITC的染色增强、荧光明亮，形成了致密浓缩的荧光特征，PI染色也呈现同样荧光特征，提示质膜的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine)外翻以及对细胞核破坏更严重，发生了更显著的细胞凋亡。因此，通过对荧光染色的凋亡细胞的形态观察，也证实了MNPs对Pb2+的吸附能够显著降低Pb2+导致的细胞凋亡水平，与表2和表3结果一致。

图4 细胞经过Pb2+与MNPs-Pb作用12 h后凋亡早、晚期细胞荧光染色形态图注：(a) 1 μg·mL-1 Pb2+组，(b) 3 μg·mL-1 Pb2+组，(c) 5 μg·mL-1 Pb2+组，(d) MNPs-1 μg·mL-1 Pb组，(e) MNPs-3 μg·mL-1 Pb组，(f) MNPs-5 μg·mL-1 Pb组。Fig. 4 Fluorescent staining and morphology of early and late apoptosis cells treated with Pb2+ and MNPs-Pb after 12 hNote: (a) 1 μg·mL-1 Pb2+ group, (b) 3 μg·mL-1 Pb2+ group, (c) 5 μg·mL-1 Pb2+ group, (d) MNPs-1 μg·mL-1 Pb group, (e) MNPs-3 μg·mL-1 Pb group, (f) MNPs-5 μg·mL-1 Pb group.

3 讨论(Discussion)

体外毒性实验是纳米毒理学的重要评估方法。本研究使用大鼠肾细胞作为研究对象，评估MNPs-Pb复合物对细胞的毒性效应。细胞活性实验及细胞形态观察结果说明，高剂量Pb2+作用能导致大鼠肾细胞活性的显著性降低及形态结构的显著改变；MNPs-Pb复合物显著降低了Pb2+对细胞活性的抑制和对细胞形态结构的显著改变，复合物和MNPs对细胞活性只有轻微抑制，对细胞形态和结构没有显著改变。有研究发现，MNPs在<200 μg·mL-1条件下对细胞没有显著毒性效应，在浓度高达400 μg·mL-1时对细胞也只有程度较低的活性抑制和形态改变，未表现出显著毒性[10,19]。Hildebrand等[20]研究动物细胞暴露于MNPs与Pd的复合物时发现，细胞活性短期内略微降低，作者认为这可能是细胞短期内应激反应的结果，不会对细胞产生显著毒性作用。因此，本实验的结果证明了MNPs-Pb对细胞无显著的毒性作用。

纳米颗粒在细胞内的摄取与细胞毒性直接相关，其毒性作用通常与3个方面有关：(1)纳米颗粒进入重要细胞器，如线粒体、细胞核等，影响细胞正常生理功能[19]；(2)产生“木马效应”，即纳米颗粒携带有毒“金属离子”释放到细胞内，引发细胞毒性的增加[21]；(3)纳米颗粒在细胞内溶解，释放出大量有毒金属离子[22]。纳米颗粒通过内吞作用被细胞摄取主要分为3种类型：吞饮作用、吞噬作用和受体介导的内吞作用，最常见的是非特异性的吞饮作用，以质膜包被颗粒物，内陷形成囊泡及初级溶酶体[17]。由于MNPs-Pb表面无生物配体，因此非特异性的吞饮作用可能是其进入细胞的方式。非特异性的内吞作用与纳米颗粒尺寸密切相关，相同纳米浓度下，较小的颗粒更易于被细胞摄取[17-18]。纳米颗粒被细胞有效摄取的尺寸阈值为200 nm[17]，由于MNPs-Pb和MNPs水合粒径均大于此阈值，且MNPs-Pb的水合粒径更大，因此在相同纳米颗粒浓度下，细胞对MNPs-Pb和MNPs的摄取量很低，且MNPs-Pb摄取量低于对MNPs的摄取量。研究发现，多种磁性氧化铁纳米材料被细胞摄取后，通常会聚集于内体、溶酶体或细胞质内，在重要细胞器中未发现纳米颗粒[19,22]，与本研究中TEM观察结果一致。

对裸核MNPs和表面修饰的MNPs的一项研究表明，进入细胞溶酶体内的纳米颗粒96 h后仍保持原有化学形态，对细胞没有显著毒性影响[22]，因此，12 h的暴露时间内，MNPs和MNPs-Pb在细胞内性质稳定，可能不会有大量Fe2+/Fe3+溶解。而另一项关于MNPs对Pb2+的吸附实验结果表明，形成的MNPs-Pb在1 mmol·L-1的硝酸作用下，仅有少量Pb2+溶解到溶液中，而未加入硝酸的溶液中，几乎没有Pb2+从MNPs-Pb上脱落[11]。由于<2.07 μg·mL-1的Pb2+对细胞影响较小[23]，在接近中性的生理环境中，12 h的暴露时间，微量的MNPs-Pb被细胞摄取，可能不会有大量能导致细胞毒性的Pb2+脱落。Auffan等[21]研究与MNPs性质类似的纳米γ-Fe2O3与As的复合物对动物细胞作用时也发现了类似现象，即细胞对复合纳米颗粒的微量摄取，在细胞内未发生“木马效应”导致显著的细胞毒性。综上所述，被摄取的微量MNPs-Pb可能不会对细胞产生显著毒性效应。

尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是半胱天冬酶(caspase)在凋亡过程中起着必不可少的作用。细胞凋亡主要包含2种重要机制，对于外源性凋亡，外来信号与死亡受体发生作用活化半胱天冬酶，进一步引发凋亡；对于内源性凋亡，线粒体受损可能会激活细胞色素C的释放，并进一步激活半胱天冬酶的级联反应[24-25]。在Pb2+诱导的细胞凋亡机制中，线粒体途径被认为是介导凋亡的主要方式，Pb2+可以诱导胞内产生大量自由基，破坏线粒体功能，影响线粒体的融合与分离，导致线粒体损伤并最终引发凋亡[26]。本研究中，流式细胞仪对凋亡水平的分析和凋亡形态学观察结果表明，Pb2+可以导致细胞凋亡率上升，而MNPs对Pb2+的吸附，能够显著降低Pb2+通过线粒体途径导致的细胞凋亡，从而减少Pb2+对细胞的损伤和毒性作用。由于Pb2+导致的细胞凋亡是Pb2+引起肾脏毒性的重要机制之一[27]，而少量的细胞凋亡不破坏整个组织结构，不引发炎症反应，能很好地维持器官的功能稳定[28-29]，因此，可以通过MNPs对Pb2+的吸附降低Pb2+导致的肾脏损伤。李专等[19]研究MNPs与Cr6+的复合物的细胞毒性时也发现了类似现象，即MNPs对Cr6+的吸附，降低了Cr6+导致的细胞凋亡，复合物本身未导致大量细胞凋亡，减弱了对细胞的毒性作用。

综上所述，在本实验浓度和暴露时间条件下，Pb2+能够显著抑制大鼠肾细胞活性，改变细胞形态，促进细胞凋亡，对细胞有显著的毒性作用，并且呈现剂量相关性；在本实验浓度和暴露时间下，利用MNPs吸附水环境中Pb2+形成的复合物MNPs-Pb对大鼠肾细胞没有显著的毒性作用，MNPs对Pb2+的吸附可能是Pb2+的细胞毒性降低的原因。

急性毒性效应反映细胞短期内的损伤情况，但不能确定细胞长期的病理变化。本研究选择了单一浓度的MNPs与不同浓度的Pb2+在短时间内进行单独和联合暴露实验，而复合毒性与污染物的浓度范围、混合配比以及暴露时间密切相关，因此，不同浓度、配比的MNPs和Pb2+对细胞的长期复合作用及作用机理需要进一步的研究和确认。