IFN-α调控miR-214-5p/MFGE8通路对人脑血管外膜成纤维细胞增殖、凋亡的影响

郭延兵 姚庆和 王新军

血管外膜成纤维细胞(vascular adventitial fibroblasts，VAFs)是细胞外膜的重要细胞组分之一，其增殖和凋亡之间的失衡导致新生内膜形成和病理性血管重构，在高血压、冠心病、动脉粥样硬化、血管再狭窄等血管增生性疾病的病理结局中起决定性作用[1]。干扰素(Interferon，IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗菌、影响细胞增殖、凋亡以及分化、调节免疫功能等多种生物活性的细胞因子家族。近年来研究显示，IFN-α通过调控基因表达在血管增生性疾病中发挥重要作用[2]。miR-214-5p是一类与心血管疾病密切相关的微小RNA(microRNA，miRNA)，研究显示冠心病患者血浆中miR-214-5p表达失调与冠状动脉侧支循环形成显著相关[3]。miR-214-5p介导运动对心脏的保护作用，是心血管运动康复和其他干预措施的靶点[4]。

乳脂肪球表皮生长因子8(milk fat globule epidermal growth factor 8，MFGE8)是一种分泌性糖蛋白，其可整合细胞内信号清除死亡细胞，介导血管细胞和胞外基质在应激下的不良反应，参与血管衰老和血管重构[5]。生物信息学分析显示MFGE8是miR-214-5p的潜在靶基因，但IFN-α能否调控miR-214-5p/MFGE8通路进而影响VAFs的增殖和凋亡尚未见文献报道。因此，本研究拟通过观察IFN-α对miR-214-5p和MFGE8表达以及人脑血管外膜成纤维细胞(human cerebral vascular adventitial fibroblasts，HBVAFs)增殖和凋亡的影响，揭示其作用机制，以期为IFN-α、miR-214-5p/MFGE8通路在治疗血管增生性疾病中的应用奠定理论基础。

材料与方法

1.材料与试剂:HBVAFs细胞购自上海泽叶生物科技有限公司；DMEM培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司；干扰素购自北京三元基因药业股份有限公司；miRNA抑制物对照(anti-miR-con)、miR-214-5p抑制物(anti-miR-214-5p)、空载体(pcDNA)、MFGE8过表达载体(pcDNA-MFGE8)、小干扰RNA对照(si-con)、MFGE8小干扰RNA(si-MFGE8)、野生型荧光素酶报告基因载体(WT-MFGE8)、突变型荧光素酶报告基因载体(MUT-MFGE8)以及PCR引物由上海生工生物工程公司提供；四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)试剂盒购自美国Sigma公司；膜联蛋白V异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(annexin V-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；兔源活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)抗体、兔源B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukaemia-2，Bcl-2)抗体和兔源Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗体购自美国CST公司；兔源MFGE8抗体购自美国Santa Cruz公司；β-actin抗体和山羊抗兔Ⅱ抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

2.细胞分组和处理：复苏细胞后，采用含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、湿度80%、含5% CO2的细胞培养箱中培养，当细胞密度80%时进行传代培养。将P3代生长良好的HBVAFs细胞分为8组，正常培养的HBVAFs细胞为NC组；用终浓度为2000U/ml的IFN-α处理HBVAFs细胞24h标记为IFN-α组[2]；将anti-miR-con、anti-miR-214-5p、pcDNA、pcDNA-MFGE8分别转染HBVAFs细胞后，用2000U/ml的IFN-α处理细胞24h依次标记为IFN-α+anti-miR-con组、IFN-α+anti-miR-214-5p组、IFN-α+pcDNA组、IFN-α+pcDNA-MFGE8组；将anti-miR-214-5p分别与si-con、si-MFGE8共转染至HBVAFs细胞后，用2000U/ml的IFN-α处理细胞24h，依次标记为IFN-α+anti-miR-214-5p+si-con组和IFN-α+anti-miR-214-5p+si-MFGE8组。

3.qRT-PCR检测miR-214-5p和MFGE8 mRNA的表达水平：以TRIzol法提取各组HBVAFs细胞的总RNA，参照反转录试剂盒说明书合成cDNA，以cDNA为模板参照qRT-PCR试剂盒说明书进行PCR扩增。其中miR-214-5p上游引物序列为5′-TCTCTTGCTATAGAAGCACAAC-3′，下游引物序列为5′-TCCTCCACAATCATGCTGTGT-3′；U6上游引物序列为5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列为5′-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3′；MFGE8上游引物序列为5′-GTGCGTGTGACCTTCTTG-3′，下游引物序列为5′-ACCTGTTACCCACATCCT-3′；β-actin上游引物序列为5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3′，下游引物序列为5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′。分别以U6和β-actin为内参照，采用2-ΔΔCt法计算miR-214-5p和MFGE8 mRNA的相对表达水平。

4.MTT法检测细胞活力：胰蛋白酶消化处理HBVAFs细胞并接种于96孔板，按照上述方法进行相应处理。终止培养前4h向每孔内加入20μl质量分数为5mg/L的MTT。弃去培养基后，加入150μl的DMSO室温震荡10min，全自动酶标仪检测490nm波长处的吸光度。

5.流式细胞术检测细胞凋亡:收集各组细胞，磷酸盐缓冲液洗涤细胞后，加入适量的结合缓冲液调整细胞浓度为1×106/ml。取100μl细胞悬液加入到流式管，按照annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒分别加入5μl的annexin V-FITC和5μl的PI，混匀后室温避光孵育15min，补加400μl的结合缓冲液后，立即上机检测细胞凋亡情况。

6.Western blot法检测MFGE8、Cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表达：收集各组细胞，加入RIPA裂解液提取各组细胞的总蛋白，参照BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度和纯度。取适量的细胞蛋白，加入等体积的2×上样缓冲液充分混匀后，置于沸水浴中变性5min。取30μg已变性的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完毕后，采用转膜装置将已分离的细胞蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜，接着采用5%脱脂牛奶的封闭液室温条件封闭1h。将Ⅰ抗按照相应的比例稀释后，室温孵育膜1h，采用TBST洗膜10min，洗3次后，用已稀释的Ⅱ抗室温孵育膜1h，TBST漂洗膜3次后，加入化学发光试剂进行显色，随后于凝胶成像系统进行曝光和拍照分析。

7.双荧光素酶报告基因实验验证miR-214-5p和MFGE8的靶向关系：生物信息学软件targetscan预测显示miR-214-5p与MFGE8的3′-UTR区域存在部分连续互补的核苷酸序列，推测MFGE8是miR-214-5p的靶基因并利用双荧光素酶报告基因实验验证二者的靶向关系。将含MFGE8的3′-UTR的野生型荧光素酶报告基因载体WT-MFGE8与突变型荧光素酶报告基因载体MUT-MFGE8分别与miR-214-5p 模拟物、miR-con共转染至HBVAFs细胞，转染6h后更换细胞培养液，转染48h检测各组细胞的荧光素酶活性。为证实miR-214-5p对MFGE8的调控关系，分别将miR-con、miR-214-5p、anti-miR-con、anti-miR-214-5p转染至HBVAFs细胞，转染48h检测采用Western blot法检测MFGE8蛋白表达水平变化。

结 果

1.IFN-α对人脑血管外膜成纤维细胞miR-214-5p和MFGE8表达的影响:与NC组比较，IFN-α组人脑血管外膜成纤维细胞中miR-214-5p的表达水平(6.43±0.77 vs 1.00±0.12)显著升高，MFGE8 mRNA(0.41±0.05 vs 0.86±0.09)和MFGE8蛋白(0.29±0.04 vs 0.65±0.07)的表达水平显著降低(P<0.05，图1)。

图1 Western blot法检测人脑血管外膜成纤维细胞MFGE8表达

2.干扰miR-214-5p促进IFN-α诱导人脑血管外膜成纤维细胞增殖：与NC组比较，IFN-α组人脑血管外膜成纤维细胞miR-214-5p的表达水平显著升高，细胞活力显著降低；与IFN-α+anti-miR-con组比较，IFN-α+anti-miR-214-5p组人脑血管外膜成纤维细胞miR-214-5p的表达水平显著降低，细胞活力显著增加(P<0.05)，详见表1。

3.干扰miR-214-5p抑制IFN-α诱导人脑血管外膜成纤维细胞凋亡:与NC组比较，IFN-α组人脑血管外膜成纤维细胞Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表达水平显著升高，Bcl-2蛋白的表达水平显著降低，细胞凋亡率显著增加；与IFN-α+anti-miR-con组比较，IFN-α+anti-miR-214-5p组人脑血管外膜成纤维细胞Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表达水平显著降低，Bcl-2蛋白的表达水平显著升高，细胞凋亡率显著降低(P<0.05),详见表2、图2。

表1 MTT检测人脑血管外膜成纤维细胞活力

与NC组比较，*P<0.05；与IFN-α+anti-miR-con组比较，#P<0.05

表2 干扰miR-214-5p抑制IFN-α诱导的人脑血管外膜成纤维细胞凋亡和影响Cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达

与NC组比较，*P<0.05；与IFN-α+anti-miR-con组比较，#P<0.05

图3 miR-214-5p与MFGE8存在靶向序列并调控其蛋白表达A.miR-214-5p与MFGE8存在连续互补核苷酸序列；B.Western blot法检测蛋白表达

4.miR-214-5p靶向调控MFGE8表达:通过targetscan网站在线预测显示，miR-214-5p与MFGE8的3′-UTR区域存在部分连续互补的核苷酸序列(图3A)。双荧光素酶报告实验显示，与miR-con和WT-MFGE8共转染组比较，miR-214-5p 模拟物和WT-MFGE8共转染组人脑血管外膜成纤维细胞的荧光素酶活性(0.67±0.09 vs 1.00±0.08)显著降低(P<0.05)；与miR-con和MUT-MFGE8共转染组比较，miR-214-5p 模拟物和MUT-MFGE8共转染组人脑血管外膜成纤维细胞的荧光素酶活性变化比较(1.07±0.12 vs 1.11±0.16)，差异无统计学意义(P>0.05)。与miR-con组比较，miR-214-5p组人脑血管外膜成纤维细胞MFGE8蛋白的表达水平(0.26±0.03 vs 0.58±0.06)显著降低；与anti-miR-con组比较，anti-miR-214-5p组人脑血管外膜成纤维细胞MFGE8蛋白的表达水平(0.89±0.09 vs 0.51±0.05)显著升高(P<0.05,图3B)。

5.过表达MFGE8促进IFN-α诱导的人脑血管外膜成纤维细胞增殖抑制细胞凋亡：与IFN-α+pcDNA组比较，IFN-α+pcDNA-MFGE8组人脑血管外膜成纤维细胞MFGE8蛋白的表达水平显著升高，细胞活力显著增加，Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表达水平显著降低，Bcl-2蛋白的表达水平显著升高，细胞凋亡率显著降低(P<0.05),详见表3和图4。

表3 过表达MFGE8促进IFN-α诱导的人脑血管外膜成纤维细胞增殖抑制细胞凋亡

与IFN-α+pcDNA组比较，*P<0.05

图4 流式细胞术检测细胞凋亡和Western blot法检测MFGE8、Cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达A.流式细胞术检测细胞凋亡；B.Western blot法检测蛋白表达

6.干扰MFGE8部分反转anti-miR-214-5p对IFN-α诱导的人脑血管外膜成纤维细胞增殖和凋亡的作用:与IFN-α+anti-miR-con+si-con组比较，IFN-α+anti-miR-214-5p+si- MFGE8组人脑血管外膜成纤维细胞MFGE8蛋白的表达水平显著降低，细胞活力显著降低，Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表达水平显著增加，Bcl-2蛋白的表达水平显著降低，细胞凋亡率显著增加(P<0.05),详见表4和图5。

讨 论

近年来，随着对血管增生性疾病研究的不断深入，发现血管外膜成纤维细胞的激活、过度增殖、细胞表型转化是血管增生性疾病进展的关键环节[1]。如何有效地抑制血管外膜成纤维细胞增殖，促进其凋亡对防治血管增生性疾病具有重大意义。

表4 干扰MFGE8和anti-miR-214-5p对IFN-α诱导的人脑血管外膜成纤维细胞增殖和凋亡的影响

与IFN-α+anti-miR-con+si-con组比较，*P<0.05

图5 流式细胞术检测细胞凋亡和Western blot法检测MFGE8、Cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达A.流式细胞术检测细胞凋亡；B.Western blot法检测蛋白表达

IFN被广泛认为是先天免疫应答的一个组成部分，自1957年首次发现干扰素以来，目前已有多种干扰素相继被发现，根据不同受体主要将IFN分为Ⅰ型(IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IFN-δ和IFN-τ)、Ⅱ型(IFN-γ)和Ⅲ型(IFN-λ)3种亚型[6]。研究发现，IFN-α通过诱导干扰素诱导蛋白16(interferon-inducible protein 16，IFI16)和P21蛋白表达上调，降低血管内皮细胞活力，诱导细胞凋亡[7，8]。IFN-α还可抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖和诱导其凋亡[9,10]。此外，IFN-α还可抑制血管外膜成纤维细胞的增殖与迁移，促进其凋亡[11]。本研究发现IFN-α可显著降低血管外膜成纤维细胞活力，降低促凋亡蛋白Cleaved caspase-3和Bax的表达，促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡,与上述研究结论一致，提示采用IFN-α治疗血管增生性疾病具有一定的可行性。

长期起来对miR-214-5p的研究多集中在肿瘤方面，已在骨肉瘤、肝癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤中发现miR-214-5p的抗肿瘤作用[12～14]。近年来miR-214-5p在心血管疾病中的作用才逐渐被揭示。研究显示，miR-214-5p水平的降低与胎盘生长因子水平的升高和动脉粥样硬化的恶化有关，miR-214-5p是重度冠状动脉疾病潜在的保护剂和生物学标志物[15]。miR-214-5p通过靶向NCK相关蛋白1(NCK association protein 1，NCKAP1)在一定程度上抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移，防止血管损伤后新生内膜平滑肌细胞增生[16]。然而，另一项研究则表明抑制miR-214-5p表达对心肌肥大和心理衰竭具有治疗作用[17]。本研究显示IFN-α干预处理促进血管外膜成纤维细胞miR-214-5p表达，干扰miR-214-5p表达则反转IFN-α对血管外膜成纤维细胞的增殖抑制和凋亡促进作用。提示IFN-α抗血管外膜成纤维细胞作用与上调miR-214-5p表达有关。

MFGE8与人类疾病进展密切相关，研究显示MFGE8表达增加，个体表现出更高的冠状动脉疾病风险，抑制MFGE8表达可抑制冠状动脉平滑肌细胞增殖，具有抗动脉粥样硬化作用[18]。在黑色素瘤中，间充质基质细胞产生大量的MFGE8，MFGE8促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和内皮素1(endothelin 1，ET-1)表达，导致血管生成和肿瘤生长增强。此外，糖基化低密度脂蛋白通过下调MFGE8诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞凋亡，改善MFGE8表达对糖尿病视网膜病变具有保护作用[19]。本研究显示，IFN-α干预处理显著抑制血管外膜成纤维细胞MFGE8表达，并通过双荧光素酶报告基因实验Western blot法检测证实miR-214-5p靶向负调控MFGE8表达，过表达MFGE8则反转IFN-α对血管外膜成纤维细胞的增殖抑制和凋亡促进作用。进一步研究显示，干扰MFGE8表达反转抑制miR-214-5p表达对IFN-α诱导的人脑血管外膜成纤维细胞增殖和凋亡的作用。以上研究说明IFN-α对人脑血管外膜成纤维细胞增殖抑制和凋亡促进作用与调控miR-214-5p/MFGE8通路有关。

综上所述，IFN-α通过调控miR-214-5p/MFGE8通路抑制人脑血管外膜成纤维细胞增殖，促进细胞凋亡。本研究为IFN-α在血管增生性疾病治疗中的应用奠定理论基础，miR-214-5p/MFGE8有望成为血管增生性疾病的潜在治疗靶点。