电感耦合等离子体发射光谱法测定不同来源胶原蛋白肽中Ca，P，Na及K元素的质量分数

高志新，丁树雄

(1 河北省玉田县市场监督管理局，河北 玉田，064100；2 河北省玉田县质量技术监督检验所)

胶原蛋白分子结构稳定，具有极低免疫原性和致敏性，根据其在体内的分布，分为间质胶原蛋白、基膜胶原蛋白和细胞外周胶原蛋白。机体胶原的主要形式为间质型胶原蛋白，包括Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型，分布于皮肤和肌腱等组织；基底膜胶原蛋白通常是指分布于基底膜的Ⅳ型胶原蛋白；细胞周胶原蛋白通常是指结缔组织中大量存在的Ⅴ型胶原蛋白[1]。食品工业中广泛应用的胶原蛋白肽是以富含胶原蛋白的新鲜动物组织(包括皮、骨、筋、腱、鳞等)为原料，经过提取、水解、精制生产的，相对分子质量低于10 000的产品[2]，大部分从间质型胶原蛋白分解制备而得。我国GB 31645—2018食品安全国家标准胶原蛋白肽已于2018年12月21日起正式实施，所采用的原料需为检疫合格的新鲜牛、猪和鱼等动物的皮、骨、筋、腱和鳞等，或者制革鞣制工艺前，剪切下的带毛边皮或剖下的内层皮，或者骨粒加工厂加工的清洁骨粒和自然风干的骨料及可食水生动物鱼鳔、可食棘皮动物、水母等[2～4]。

研究表明，胶原蛋白肽具有良好的食品加工特性，如溶解性、乳化性、起泡性和流动性等在饮料、面包、糕点以及冰淇淋等食品的生产中有广泛应用[5～7]。近年来文献报道多集中在胶原蛋白肽的制备工艺及其生物活性研究[8～11]，随着胶原蛋白在食品工业中的广泛应用，有必要探讨胶原蛋白肽中矿物质含量，为其应用提供数据支持。本次研究对胶原蛋白肽中K，Ca，P及Na等4种宏量矿物质营养元素进行了检测，分析不同来源胶原蛋白肽中元素质量分数差异，以期为含胶原蛋白肽的食品配方及标签设计提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 725-OES垂直观测电感耦合等离子体发射光谱仪，美国安捷伦有限公司生产(参照JJG 768—2005《发射光谱仪》国家计量检定规程计量检定合格，波长示值误差±0.03 nm，波长示值重复性≤0.005 nm，最小光谱带宽Mn 257.610 nm，半高度≤0.015 nm)；MDS-15高通量密闭微波消解仪，上海新仪微波化学科技有限公司生产；L-1000 XLS移液器，梅特勒-托利多仪器有限公司生产；GL 124电子天平，感量0.000 1 g，德国赛多利斯设备有限公司生产；PURELAB Option S-R 7-15超纯水仪，莱特莱德(北京)纯水设备技术股份有限公司生产；量筒、容量瓶及烧杯等所有器材均用体积分数为0.1的 HNO3浸泡过夜，用超纯水冲洗。Ca，K，Na，P单元素标准溶液，1 000 mg/L，均购自国家标准物质中心；HNO3为优纯级，体积分数为0.3的双氧水为分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产；实验用水为自制超纯水。

1.2 标准工作曲线

采用标准工作曲线外标法定量。取1 000 mg/L Ca，K和P元素单标各5 mL，Na元素单标10～100 mL容量瓶中，定容混匀得到混合标准溶液，取上述混合标准溶液分别以2倍梯度稀释，介质为体积分数为0.01的HNO3溶液，得到6个质量浓度梯度标准溶液，其中，Ca，K和P元素质量浓度梯度依次为50.000，25.000，12.500，6.250，3.250，1.625 mg/L；Na元素质量浓度梯度依次为100.00，50.00，25.00，12.50，6.50，3.25 mg/L，以标准溶液稀释用溶剂为空白得到标准工作曲线系列。

1.3 样品测定

1.3.1样品来源与前处理 不同来源的胶原蛋白肽样本均为市场上流通的国内外不同生产厂家的原料产品，涵盖法国罗赛洛Rousselot，德国嘉利达 GELITA，比利时派宝 PB，日本AKAII，华达杰瑞及东宝生物等公司的产品。样品呈粉末状或细颗粒状，无结块，粉体流动性较佳，色泽为白色或淡黄色，包括猪皮(ZP)来源14例，牛皮(NP)来源16例，鱼皮(YP)来源15例。参考文献[12,13]方法，进行样本制备。称取0.5 g试样(精确至0.000 1 g)，并制备平行样1份，置于50 mL微波消解罐中，加5 mL HNO3和1 mL过氧化氢，预消解30 min，以使得消解产生的大量气体溢出，避免爆罐。罐体密封后安装温度及压力传感器，对称的置于微波消解腔内，微波消化装置消化程序为5 min从室温升至100 ℃，保持5 min，2 min升温至120 ℃，保持5 min，5 min升温至150 ℃，保持5 min，然后降至室温，消解结束。待消解罐冷却后，将溶液转移至50 mL容量瓶中，用水冲洗罐壁3次以上，并定容至刻度，混匀。平行测定2次取平均值。

1.3.2原理与仪器工作条件 将高纯惰性气体氩气在高频电磁场中形成等离子体炬。样品溶液在雾化器中被雾化后，被载气带入高温的等离子体炬中，激发各种元素的原子或离子发射出各自的特征光谱线，依据这些特征光谱线，可以进行定性或定量的元素分析。电感耦合等离子体发射光谱仪工作条件见表1。在文献[14]报道的方法步骤的基础上进行改进，进行分析测定。新建并编辑工作方法，选择各元素推荐最灵敏分析谱线作为待测元素波长及并输入标准工作曲线梯度浓度值。

表1 电感耦合等离子体发射光谱仪工作条件

项目设定值项目设定值功率/W1200雾化气压力/MPa0.2泵速/(r·min-1)15读数次数3进样延时/s20稳定延时/s10等离子体气流速/(L·min-1)15辅助气流速/(L·min-1)1.5一次读数时间/s10

1.3.3工作曲线与样品测定 仪器检测器温度降至-35 ℃，光室35 ℃恒温稳定后，继续高纯氩气吹扫30 min，以吹除系统中残余氧气，避免对低波长元素的干扰。点燃等离子体，高纯氩气大流量吹扫20 min后，等离子体趋于稳定。将制备好的工作曲线浓度梯度溶液参照仪器参考操作条件进行测定。标准曲线测定完毕后，体积分数为0.01的HNO3溶液清洗1次，超纯水清洗2次，然后再进行试剂空白和样品测定。

1.3.4检出限及回收率 取一体积分数为0.1 的HNO3溶剂空白重复测定7次，取3倍标准偏差，计算出各元素检出限；取标准曲线中间浓度溶液1 mL准确加入待测样品中，进行加标回收率分析，以考察方法的准确性。

1.3.5样品中元素含量计算 由各元素的标准系列浓度与对应的发射强度，计算出回归方程，由回归方程得出测定样液浓度C(mg/L)及溶剂空白液的浓度C0(mg/L)，样品质量为m(g)，后再由式(1)计算出样品中元素的质量分数Ci(mg/kg)。

Ci=[(C-C0)/(m·1 000)]·50·1 000

(1)

1.3.6数据统计分析 采用一元线性回归法进行标准曲线拟合，并得到相关系数；采用Graphpad Prism 5.0软件Column statistics组件进行作图；采用Microsoft Excel 2016 描述统计功能进行数据汇总分析。

2 结果与讨论

2.1 方法精密度及检出限

不同元素在相应的推荐定性定量检测波长下的标准工作曲线详见表2，净光谱强度和对应的元素浓度呈线性关系，相关系数均达到0.999以上，满足定量分析要求。方法检出限0.2～0.6 mg/L，回收率介于90.5%～103.8%。

表2 标准工作曲线、相关系数、检出限及回收率

2.2 样品元素含量

测定结果表明：鱼皮来源的胶原蛋白肽中Ca，P及Na的质量分数最高(图1)。其中，Ca的质量分数(质量分数范围3.50～35.90 mg/kg，平均14.05 mg/kg，中位数为13.30 mg/kg)显著高于猪皮来源的(质量分数范围1.81～12.46 mg/kg，平均5.23 mg/kg，中位数为3.73 mg/kg)及牛皮来源的(质量分数范围2.52～13.90 mg/kg，平均6.21 mg/kg，中位数为5.24 mg/kg)。鱼皮来源的胶原蛋白肽所用的原材料通常为各种鱼类水产品加工的下脚料，取材自不同的鱼组织部位，包括鱼皮、鱼鳍、鱼鳞、鱼鳔等，经酶解或水解而制得，与其Ca，P及Na元素组成较高有关。采用水产动物如鲫鱼、鲤鱼、鲽鱼、鲭鱼、鲢鱼、鳙鱼、草鱼等，尤其是其加工废弃物——皮、骨、鳞中含有丰富的胶原蛋白，由此制得的酶解制备胶原蛋白肽，是优良的清真蛋白质原料来源[15～18]。此外，鱼骨/鳍来源的胶原蛋白通常富含Ca元素，而Ca元素为人类必需营养矿物质元素，胶原蛋白肽和Ca元素是机体皮肤、肌腱及结缔组织的主要组成成分，两者在组织修复营养补充中可以起到协同作用[19～22]。

图1 不同来源胶原蛋白肽中Na，K，Ca及P元素的质量分数

Na元素在鱼皮来源的胶原蛋白肽中质量分数最高(质量分数范围15.60～93.90mg/kg，平均63.81 mg/kg，中位数为67.40 mg/kg)，显著高于猪皮来源的(质量分数范围16.30～80.30mg/kg，平均47.84mg/kg，中位数为49.55 mg/kg)及牛皮来源的(质量分数范围7.40～87.20 mg/kg，平均55.36 mg/kg，中位数为64.50 mg/kg)。Na元素是预包装食品营养标签中必须标示的项目之一，胶原蛋白肽作为食品原料之一，有必要对其Na元素质量分数进行摸底，为产品配方设计提供依据。此外，由于不同来源的胶原蛋白肽中Na元素质量分数范围跨度较大，因此通过对胶原蛋白肽原料进行Na元素质量分数的检测，筛选适合的来源和供应商，并对来料进行批次检验，以避免对预包装食品中Na的质量分数造成较大影响。

此外，研究结果显示，鱼皮来源的胶原蛋白肽中P的质量分数(质量分数范围0.40～22.30 mg/kg，平均10.10 mg/kg，中位数为6.39 mg/kg)显著高于猪皮来源的(质量分数范围0.35～18.60 mg/kg，平均3.24 mg/kg，中位数为1.73 mg/kg)及牛皮来源的(质量分数范围0.70～21.30 mg/kg，平均8.93 mg/kg，中位数为8.22 mg/kg)。牛皮来源的胶原蛋白肽中K的质量分数在3种原料来源中最高(质量分数范围7.95～31.20 mg/kg，平均18.67 mg/kg，中位数为20.30 mg/kg)，显著高于猪皮来源的(质量分数范围1.94～23.90 mg/kg，平均11.31 mg/kg，中位数为10.90 mg/kg)及鱼皮来源的(质量分数范围3.80～23.10 mg/kg，平均12.12 mg/kg，中位数为12.90 mg/kg)。本次研究选取的同一来源的胶原蛋白肽样本，各元素的质量分数仍然有较大差异，可能与其产地及加工工艺有关。胶原蛋白肽的制备方法包括化学分解法和酶解法。其中，广泛采用的胶原蛋白肽制备方法为酶解法，如中性蛋白酶、碱性蛋白酶及菠萝蛋白酶等，而酶解效果影响因素包括酶种类、酶活力、酶用量、作用温度及时间、体系pH等[7]，为了控制适宜的酶解体系pH，会加入标准规定的食品工业用加工助剂，胶原蛋白肽酶解体系通常应用磷酸缓冲盐进行最佳pH的控制，因此，同一来源胶原蛋白肽中P，K及Na元素质量分数的差异，可能为工艺参数差异所致。

3 结 论

本次研究应用微波消解联合电感耦合等离子体发射光谱分析技术建立了不同胶原蛋白肽中Ca，P，Na及K元素质量分数的同时检测方法。采用建立该方法进行了实际样品测定。结果显示：鱼皮来源的胶原蛋白肽中，Ca，Na，P的质量分数较高；牛皮来源的胶原蛋白肽中，K的质量分数较高。鱼皮来源的胶原蛋白肽可作为优良的补Ca营养食品。不同来源的胶原蛋白肽的Ca，Na，K及P质量分数差异较大，在食品工业中应用时建议进行各元素质量分数摸底，以选择适宜原料的胶原蛋白肽。同一来源的胶原蛋白肽中同一元素的质量分数仍然有较大差异，可能与产品的制备工艺相关。