喷雾干燥入口温度对鸡蛋清蛋白粉功能特性和结构的影响

刘丽莉，陈 珂，李媛媛，杨晓盼，郝威铭

(河南科技大学 a.食品与生物工程学院；b.食品加工与安全国家级教学示范中心，河南 洛阳 471023)

0 引言

鸡蛋清蛋白粉采用新鲜鸡蛋为原料[1]，是新鲜鸡蛋清的理想替代品[2]，具有占用空间比壳蛋和液蛋少，储藏和运输成本低等优点[3]，因此被广泛应用于食品、制剂、化妆品和化学等工业领域中。目前，喷雾干燥是常用的干燥方法，具有干燥过程迅速、物料受热时间短、对有效成分破坏少[4]和干燥面积大[5]等优点，适于工业大规模生产[6]。

国内外关于喷雾干燥加工鸡蛋清蛋白粉的研究有很多。文献[7]研究了喷雾干燥鸡蛋清蛋白(egg white protein,EWP)的最佳过程和质量特性。文献[8]研究了喷雾干燥条件(进气温度和喷嘴压力)对鸡蛋清蛋白粉功能和性能的影响，发现随着进气温度的升高，鸡蛋清蛋白粉发泡力和蛋白溶解度降低。文献[9]研究了喷雾干燥温度、储存温度和储存时间对蛋黄粉末物理和功能特性的影响。文献[10]研究了喷雾干燥入口温度和储存条件对干蛋白的物理和功能特性的影响。文献[11]研究了工业加工步骤对鸡蛋清干燥蛋白质结构和功能的影响，确定损害蛋白功能特性的加工步骤，并了解损害发生的机制以限制这些影响和减少干燥加热时间。文献[12]探讨了喷雾干燥条件对鸡蛋清蛋白粉特性的影响，解决鸡蛋清蛋白粉易结块和稳定性差的问题。文献[13]研究了乌鸡鸡蛋全粉喷雾干燥工艺，利用响应面分析法优化了乌鸡鸡蛋全粉喷雾干燥条件。文献[14]通过喷雾和真空冷冻2种干燥方式制备全蛋粉，并对干燥后得到的全蛋粉的理化性质和功能进行了对比。

综上所述，现有研究已优化了鸡蛋清蛋白粉的喷雾干燥工艺条件，分析了不同干燥方式对某些蛋白功能特性的影响，但不同喷雾干燥温度对鸡蛋清蛋白粉的功能特性及其结构的影响还少有报道。因此，本文拟使用不同喷雾干燥入口温度(以下简称干燥温度)对鸡蛋清进行干燥处理，对鸡蛋清蛋白功能和结构性质进行深入探讨，以期进一步解释不同干燥温度对蛋液蛋白质体系的作用机制，为鸡蛋清蛋白粉的生产加工提供理论依据。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

新鲜鸡蛋，购于河南省洛阳市大商新玛特超市；溴酚蓝(分析纯)，上海一研生物有限公司；二硫硝基苯(5,5′-dithio-2-nitrobenzoate，DTNB)，分析纯，美国Sigma-Aldrich公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，分析纯，山东玉岭化工有限公司；牛血清白蛋白，分析纯，上海谱振生物科技有限公司；尿素，分析纯，上海山浦化工有限公司。

1.2 仪器与设备

6000Y型喷雾干燥机，上海Bilon仪器有限公司；H1650型台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；TES-135型水分活度仪，上海精密仪器仪表有限公司；Cary eclipse型荧光分光光度计，美国Aglient公司；HP DSC1型差示扫描量热仪，费尔伯恩实业发展有限公司；UV-160PC型紫外分光光度计，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；Spectrum 10型傅里叶变换红外光谱仪，上海铂金埃尔默仪器有限公司；HP-200型精密色差仪，上海汉普光电科技有限公司；JSM-7500F型扫描电子显微镜，富瑞博国际有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鸡蛋清蛋白的喷雾干燥处理

使用6000Y型喷雾干燥机为试验机，采用气流喷雾方式，干燥介质为热空气，入口温度分别设为140 ℃、160 ℃和180 ℃，进料液速度为450 mL/h，蛋液质量分数为25%，出口温度为显示值，非人为控制。在此条件下对鸡蛋清蛋白进行干燥，在旋风收集器中收集干燥鸡蛋清蛋白粉，4 ℃保存备用[15]。

1.3.2 鸡蛋清蛋白粉的功能特性测定

(1)溶解度的测定

将不同喷雾干燥温度制备的鸡蛋清蛋白粉溶于去离子水中，配制成1 mg/mL的鸡蛋清蛋白溶液(pH7)，在室温下磁力搅拌30 min，分散体经10 000 r/min离心20 min，取上清液，测定上清液中蛋白质的含量[16]。

(2)起泡性的测定

配制10.0 mg/mL的鸡蛋清蛋白粉溶液100 mL，然后8 000 r/min高速搅打5 min，最后把样液移至500 mL的量筒中，测量泡沫体积及液体体积[17]。

(3)持水性的测定

准确称取1 g鸡蛋清蛋白粉于10 mL离心管中，并加入8 mL、pH7的蒸馏水；然后在振荡器上振荡1 h，将样液在室温下静置30 min；最后放入离心机中离心10 min，转速为3 800 r/min，吸去离心管中多余水分，称取残留物的质量[18]。

(4)持油性的测定

准确称取1 g鸡蛋清蛋白粉于10 mL离心管中，并加入4 mL一级大豆油，在振荡器上振荡1 h，然后将样液在室温下静置30 min，在转速为4 000 r/min的离心机中离心10 min，吸取上层未吸附的大豆油，最后称取离心管质量[19]。

(5)水分活度的测定

利用水分活度仪测定鸡蛋清蛋白粉的水分活度。每个样品重复3次，取平均值。

(6)色泽的测定

利用色差分析仪，分别对3种喷雾干燥温度制备的鸡蛋清蛋白粉进行色度测量，L*代表明度差异值，a*代表红/绿差异值，b*代表黄/蓝差异值，然后与白色标板进行比较，分析样品色差的变化。对测量的每个样品重复3次，取其平均值[20]。

(7)浊度的测定

取一定质量的鸡蛋清蛋白粉于离心管中，加入pH7.4磷酸盐缓冲液(含19 mL 0.05 mol/L NaH2PO4·H2O和81 mL 0.05 mol/L Na2HPO4·2H2O)中，配制成2.5 mg/mL的样品溶液，静置20 min。以不加样的磷酸盐缓冲液作为空白对照，采用紫外分光光度计在340 nm波长处测定样液的吸光值[21]。

(8)表面疏水性的测定

用pH7.4、20 mmol/L的磷酸盐缓冲液溶解鸡蛋清蛋白粉，制成蛋白质质量浓度为2.5 mg/mL的溶液，取1 mL样液加入到10 mL离心管中，并加入200 μL、1 mg/mL的溴酚蓝，涡旋振荡10 min，以未加样液的磷酸盐缓冲液作为空白对照。然后4 000 r/min离心15 min，取400 μL上清液稀释10倍，在595 nm波长处测定吸光值，记作A1，对照组为1 mL 20 mmol/L的磷酸盐缓冲液和200 μL 1 mg/mL的溴酚蓝[22]，其吸光值为A0。

(9)总巯基和游离巯基的测定

游离巯基的测定取0.5 mL 2 mg/mL鸡蛋清蛋白液加入到10 mL离心管中，加入5 mL Tris-甘氨酸缓冲液(含0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，4 mmol/L Na2EDTA，pH8.0)中，再加入0.1 mL Ellman试剂，漩涡混匀后于25 ℃条件下反应15 min，测定其OD412 nm。以不加Ellman试剂的溶液作为对照，每组样品测定3次，取平均值。

总巯基的测定：取2 mL鸡蛋清蛋白液，加入5 mL Tris-甘氨酸-8 mol/L尿素-0.5%SDS溶液中，再加入4 mg/mL DTNB的Ellman试剂0.1 mL，涡旋混匀后于25 ℃条件下反应15 min，测定其OD412 nm，以不加Ellman试剂的溶液作为对照，每组样品测定3次取平均值[23]。

1.3.3 鸡蛋清蛋白的结构表征

(1)荧光光谱(fluorescence spectrum,FS)的测定

将鸡蛋清蛋白粉溶于pH7.4的Tris-HCl缓冲液中，配制成1 mg/mL的蛋白溶液。取150 μL蛋白溶液置于3 mm石英比色皿中，然后移至荧光池中，激发波长为285 nm，扫描290～450 nm的荧光光谱(激发、发射狭缝宽度均为5 nm)，扫描速率为12 000 nm/min，扫描32次[24]。

(2)差式扫描量热(differential scanning calorimeter,DSC)的测定

绩效评价应当涵盖农业科研项目的全过程，即活动的投入、过程、产出以及活动的效果，将绩效评价视为连续、系统的过程，注重项目全过程考核。所谓投入类指标是反映农业科研投入的人力、物力和财力的变量，如农业科研经费数、专项主持人情况等。过程类指标是反映农业项目研究过程中对预算执行质量的控制，如该项目是否按进度开展，财政资金的使用有无浪费等。

精确称取8.0 mg鸡蛋精蛋白粉于铝坩埚中，扫描速度为10 ℃/min，扫描温度为20～200 ℃，以空盘作参比，得到DSC扫描曲线[25]。

(3)傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectrometer,FT-IR)的测定

准确称量鸡蛋清蛋白样品，加入一定量的KBr，用研钵充分研磨成均匀粉末，压制成透明薄片[26]，然后用傅里叶变换红外光谱仪进行全波段扫描(4 000～400 cm-1)，扫描32次，分辨率为4 cm-1。

(4)扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)的测定

将处理好的鸡蛋清蛋白粉用导电胶固定在样品台上，然后在溅射电压1.1～1.2 kV，真空度133.322×10-3Pa条件下调节扫描电子显微镜至最佳拍摄视野，并放大倍数，最后选择有代表性的区域进行观察拍摄[27]。

1.3.4 数据处理

试验所涉及到的测定结果均进行3次重复。采用Origin 9.0软件作图。采用SPSS软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 牛血清白蛋白标准曲线的绘制

利用Origin 9.0软件绘制牛血清白蛋白标准曲线，如图1所示。由图1可知：牛血清白蛋白标准曲线的回归方程为y=0.002 3x+0.063 4，R2=0.999 1。根据标准曲线可计算出样品蛋白质的质量浓度，该方程线性较好，可用于下一步试验。

图1 牛血清白蛋白标准曲线

2.2 干燥温度对鸡蛋清蛋白粉功能特性的影响

表1为3种干燥温度对鸡蛋清蛋白粉溶解度、起泡性、持水性、持油性和水分活度的影响。从表1中可以看出：溶解度反映冲调性能的好坏，大小顺序依次为160 ℃>180 ℃>140 ℃(P<0.05)。起泡性反映泡沫的起泡程度，大小顺序依次为160 ℃>180 ℃>140 ℃(P<0.05)。干燥温度为160 ℃时，由于蛋白质聚集的破坏，蛋白质复合物解离分散，导致更多可溶性蛋白质分散到溶液中，加剧了鸡蛋清蛋白粉颗粒的分散和形态变化，因此溶解度和起泡性较高。干燥温度为160 ℃时，持水性也最高，分别为140 ℃和180 ℃的1.71倍和1.32倍。干燥温度为140 ℃和180 ℃时，由于蛋白质构象发生较大变化，分子间相互作用产生凝聚，使持水力减小。对于持油性而言，大小顺序依次为160 ℃>140 ℃>180 ℃(P<0.05)。干燥温度为160 ℃时，持油性最高，由于160 ℃温度较高，使蛋白质发生变化，引起蛋白质分子中的疏水基团暴露，与油脂之间发生相互作用，故持油能力较强。随着干燥温度的升高，水分活度由0.46降低至0.28，变化显著(P<0.05)。雾化后液滴传质速率随干燥温度升高而加快，因此水分活度随含水率降低而降低。干燥温度为180 ℃时，水分活度最低，表明其稳定性最好，符合工业喷雾干燥食品粉末要求的最佳稳定性范围。

表1 3种干燥温度对鸡蛋清蛋白粉溶解度、起泡性、持水性、持油性和水分活度的影响

注：同列小写字母不同表示组间差异显著(P<0.05)。下同。

2.2.2 干燥温度对鸡蛋清蛋白粉色差值的影响

3种干燥温度对鸡蛋清蛋白粉色泽的影响见表2。由表2可知：不同干燥温度制备的鸡蛋清蛋白粉的色差值有明显差异。从亮度L*值来看，干燥温度为140 ℃和160 ℃时，制备的鸡蛋清蛋白粉的L*值分别为85.20±0.09和85.65±1.14，显著低于180 ℃时制备的鸡蛋清蛋白粉的L*值(86.26±0.08)(P<0.05)。这表明不同干燥温度在一定程度上会对鸡蛋清蛋白粉的形态、表面结构和颗粒大小产生影响。

表2 3种干燥温度对鸡蛋清蛋白粉色泽的影响

注：同列小写字母不同表示组间差异显著(P<0.05)。

从表2中红度a*值可以看出：干燥温度为140 ℃和160 ℃时，制备的鸡蛋清蛋白粉的a*值分别为0.62±0.08和1.75±0.14，显著低于180 ℃时制备的鸡蛋清蛋白粉的a*值(2.03±0.09)(P<0.05)。产生这种差异的原因可能是在3种干燥温度下制备的鸡蛋清蛋白粉中均发生一定程度的羰氨反应，温度越高，反应越剧烈，红值越高。

分析表2中黄度b*值可知：干燥温度为160 ℃和180 ℃时，制备的鸡蛋清蛋白粉的b*值分别为7.34±0.11和6.75±0.07，显著低于140 ℃时制备的鸡蛋清蛋白粉的b*值(8.16±0.12)(P<0.05)。随着干燥温度的升高，b*值降低，这是因为鸡蛋清蛋白粉的水分含量降低。鸡蛋清蛋白粉的颜色在一定程度上可以反映其含水率，从而导致3种干燥温度制备的鸡蛋清蛋白粉的黄化程度差异显著。

2.2.3 干燥温度对鸡蛋清蛋白粉浊度、表面疏水性、总巯基和游离巯基的影响

3种干燥温度对鸡蛋清蛋白粉浊度、表面疏水性、总巯基和游离巯基的影响见表3。由表3可知：干燥温度从140 ℃上升到160 ℃时，鸡蛋清蛋白粉的浊度、表面疏水性、总巯基和游离巯基显著升高(P<0.05)。可能是由于干燥温度升高使解离的鸡蛋清蛋白变性聚集，形成较大的悬浮颗粒，使光发生散射，并改变了鸡蛋清蛋白分子的空间结构，诱导分子链展开，使得更多的疏水基团和分子内部越来越多的巯基被暴露出来，因此浊度、表面疏水性、总巯基和游离巯基迅速增加。当干燥温度从160 ℃上升到180 ℃时，鸡蛋清蛋白的浊度、表面疏水性、总巯基和游离巯基显著下降(P<0.05)，这可能是因为鸡蛋清蛋白聚集形成的蛋白簇生长迅速、粒径过大而发生沉降，导致对光的散射减弱，并且使展开的分子链间有接触和交联的机会，疏水聚集体重新包埋部分疏水区，分子内部的巯基暴露于分子表面，暴露的巯基进一步被氧化，形成二硫键[28]，从而引起浊度、表面疏水性、总巯基和游离巯基的下降。

表3 3种干燥温度对鸡蛋清蛋白粉浊度、表面疏水性、总巯基和游离巯基的影响

2.3 干燥温度对鸡蛋清蛋白粉结构特性的影响

2.3.1 荧光光谱分析

对不同干燥温度制备的鸡蛋清蛋白粉进行荧光光谱分析，结果见图2。由图2可知：干燥温度为140 ℃、160 ℃和180 ℃时，制备的鸡蛋清蛋白粉的荧光峰对应的λmax分别为334.00 nm、335.08 nm和337.06 nm，λmax峰位发生了不同程度的红移。红移的程度越大，表明蛋白质构象变化的程度也越大。造成此变化的原因可能是干燥温度的升高使得蛋清蛋白荧光残基处蛋白质结构更加疏松，极性增加，导致荧光光谱峰位红移[29]。这与文献[30]在热处理条件下蛋白质发生不同程度位移的结果相一致。图2显示的荧光强度大小顺序为：180 ℃>160 ℃>140 ℃，说明鸡蛋清蛋白随着干燥温度的上升，隐藏在蛋白分子内部的色氨酸残基暴露，从而使蛋白荧光强度增强，并且内部发色氨基酸被构象遮蔽，使蛋白荧光发生猝灭[31]。

2.3.2 差示量热扫描分析

对不同干燥温度制备的鸡蛋清蛋白粉进行差示量热扫描分析，结果见图3和表4。

图2 3种干燥温度制备的鸡蛋清蛋白粉的FS图

图3 3种干燥温度制备的鸡蛋清蛋白粉的DSC图

由图3可知：3种干燥温度使鸡蛋清蛋白发生了明显的变性，主要因为干燥条件会引起鸡蛋清蛋白产生不可逆的变性。干燥温度越高，其DSC曲线越往下移动。高温使蛋白质发生了变性，蛋白质的热稳定性降低，其吸收的热量不断减少，从而导致DSC曲线下移。

表4为3种干燥温度制备的鸡蛋清蛋白粉的热力学性质。由表4可知：3种干燥温度制备的鸡蛋清蛋白粉表现出不同的变性温度和热焓值。干燥温度140 ℃、160 ℃和180 ℃制备的鸡蛋清蛋白粉热变性温度分别为105.91 ℃、108.04 ℃和104.78 ℃，140 ℃和160 ℃制备的鸡蛋清蛋白粉的热变性温度比180℃的分别提高了1.13 ℃和3.26 ℃，3种干燥温度制备的鸡蛋清蛋白粉的热稳定性大小依次为160 ℃>140 ℃>180 ℃。可能原因是鸡蛋清蛋白经过不同干燥温度处理后，导致了蛋白分子的伸展，其蛋白稳定性和构象发生变化，三者含有的非共价键、共价键的数目均有所不同，其结构存在差异，因此所测定的变性温度不同。干燥温度140 ℃、160 ℃和180 ℃制备的鸡蛋清蛋白粉的热焓值分别为234.13 J/g、316.32 J/g和389.31 J/g，140 ℃和160 ℃制备的鸡蛋清蛋白粉的热焓值较180 ℃的分别降低了155.18 J/g和72.99 J/g，表明蛋白聚集程度大小顺序为180 ℃>160 ℃>140 ℃。主要是因为干燥温度破坏了鸡蛋清蛋白的构象，导致蛋白质热焓值改变，说明维持蛋白质结构稳定的氢键断裂，蛋白质有序结构变化，α-螺旋结构也在随之变化，所以3种干燥温度的热焓值不同。

表4 3种干燥温度制备的鸡蛋清蛋白粉的热力学性质

2.3.3 傅里叶变换红外光谱分析

图4 3种干燥温度制备的鸡蛋清蛋白粉的FT-IR图

对不同干燥温度制备的鸡蛋清蛋白粉进行傅里叶变换红外光谱分析，结果见图4。

如图4所示：3种干燥温度制备的鸡蛋清蛋白粉具有不同的红外光谱变化(400～4 000 cm-1)。游离态N—H的伸缩振动吸收峰出现在3 400～3 440 cm-1，但游离态N—H与分子内或分子间氢键缔合后，其吸收峰将向低波数发生移动，且与O—H的伸缩振动吸收峰重叠而峰形变宽，说明缔合程度较大。干燥温度140 ℃、160 ℃和180 ℃制备的鸡蛋清蛋白粉的酰胺A分别出现在3 295.28 cm-1、3 293.71 cm-1和3 292.19 cm-1，且呈现宽而强的吸收峰，表明其N—H伸缩振动与氢键形成了缔合体，蛋清蛋白分子多聚体中可能存在大量分子内或分子间氢键。同时，干燥温度140 ℃、160 ℃和180 ℃制备的鸡蛋清蛋白粉分别在2 962.91 cm-1、2 962.93 cm-1和2 962.03 cm-1处出现弱吸收峰，主要是由酰胺B的C—N伸缩振动产生的。综合分析表明：随着干燥温度的升高，酰胺A和酰胺B谱线都向低波数方向发生了不同程度的红移，同时两者吸收峰的相对强度都呈现渐进式减弱现象，且酰胺A的改变明显大于酰胺B，表明分子内和分子间缔合氢键减少。

结合图4中酰胺I带的峰形可知：随着干燥温度的升高，峰强度逐渐增强。从峰位变化分析，140 ℃制备的鸡蛋清蛋白粉的酰胺I带出现在1 649.99 cm-1处，较其他两个干燥温度制备的鸡蛋清蛋白粉的酰胺I带向高波数方向发生了不同程度的位移。而160 ℃和180 ℃制备的鸡蛋清蛋白粉的酰胺I带则向低波数方向红移约1 cm-1，即从1 649.99 cm-1分别移至1 648.43 cm-1和1 648.65 cm-1。说明在不同干燥温度条件下，鸡蛋清蛋白在热变性过程中随着其球状折叠结构的展开，原有的刚性结构消失，游离氨基酸残基间形成分子间氢键，肽链结构伸展，分子扩散开来，导致蛋白质的结构发生改变。

2.3.4 扫描电镜分析

对不同干燥温度制备的鸡蛋清蛋白粉进行扫描电镜分析，结果见图5。由图5可知：3种干燥温度制备的鸡蛋清蛋白粉的微观结构差异不大，均呈外形完整不规则、颗粒大小较为均一的球状结构，这与文献[7]对鸡蛋清蛋白粉微观结构的研究结果相类似。说明3种干燥温度制备的鸡蛋清蛋白粉具有良好的颗粒状均匀分布的微观结构，其良好的孔隙结构能够增加颗粒的表面积，从而增强了亲水溶液中极性基团和水的相容性，最终有利于保持鸡蛋清蛋白粉的持水性。

(a) 140 ℃

(b) 160 ℃

(c) 180 ℃

3 结论

(1)干燥温度对鸡蛋清蛋白粉的溶解度、起泡性、持水性、持油性、水分活度和色度等均有显著影响。通过对鸡蛋清蛋白粉的功能特性及色差分析，得出鸡蛋清蛋白粉的溶解度和起泡性大小均依次为160 ℃>180 ℃>140 ℃(P<0.05)。160 ℃时制备的鸡蛋清蛋白粉的持水性最高，分别为140 ℃、180 ℃的1.71倍和1.32倍；持油性大小顺序依次为160 ℃>140 ℃>180 ℃(P<0.05)。180 ℃时制备的鸡蛋清蛋白粉的水分活度最低，表明其稳定性最好。3种干燥温度制备的鸡蛋清蛋白粉的亮度L*为180 ℃>160 ℃>140 ℃，140 ℃和160 ℃时的黄度b*值显著高于180 ℃(P<0.05)。

(2)干燥温度140 ℃和160 ℃时制备的鸡蛋清蛋白粉的浊度、表面疏水性、总巯基和游离巯基显著高于180 ℃(P<0.05)。三者内源荧光峰位发生了不同程度的红移，荧光强度大小依次为180 ℃>160 ℃>140 ℃。140 ℃和160 ℃时制备的鸡蛋清蛋白粉的热变性温度较180 ℃时分别提高了1.14 ℃和3.26 ℃；热焓值较180 ℃时分别降低了155.18 J/g和72.99 J/g，140 ℃和160 ℃相比于180 ℃均可使维持蛋白质结构稳定的氢键断裂，蛋白质有序结构变化，且180 ℃时制备的鸡蛋清蛋白粉的酰胺I带向低波数方向发生红移(P<0.05)，蛋白结构均呈外形完整不规则、颗粒大小较为均一的球状结构。