佛波酯诱导THP-1分化为M0型巨噬细胞的条件优化

王文芮,李海燕,常江,2

1.上海交通大学 生物医学工程学院 (上海，200030) 2.中国科学院上海硅酸盐研究所 (上海，200050)

0 引言

近年来，随着对炎症反应在组织修复过程中的重要作用认识日益加深，开发具有良好免疫调节功能的生物活性材料成为了再生医学材料领域的研究热点，而设计开发具有免疫调节功能的新型组织再生生物活性材料的重要依据之一是阐明材料对巨噬细胞良好的调控作用及其机制。在体外实验中，由于人类原代巨噬细胞获取困难，难以扩增且成本高昂[1]，因此通常利用佛波酯 (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate,PMA) 将人急性单核细胞性白血病细胞THP-1诱导分化为M0型巨噬细胞。但是，以往文献报道的PMA刺激条件并不一致且存在较大差异，PMA浓度从5 ng/mL到400 ng/mL不等[2-6]，而刺激时间则从3 h到72 h不等[1,6-8]。因此，为了筛选并优化诱导THP-1分化为M0型巨噬细胞使用的PMA刺激条件，本研究在目前报道较多的PMA浓度范围 (25～100 ng/mL) 和刺激时间范围 (24～72 h) 内，比较分析了不同刺激条件对THP-1细胞的形态变化、贴壁程度、M0型巨噬细胞表面标志物以及M1和M2型巨噬细胞标志基因表达的影响，并最终获得较优化的PMA浓度和刺激时间。

1 材料与方法

1.1 材料

THP-1细胞(ZQ0086)和RPMI-1640完全培养基(ZQ-206)购自上海中乔新舟生物科技有限公司；佛波酯购自Sigma-Aldrich公司(P1585)；CCK-8试剂盒(C0038)购自上海碧云天生物技术有限公司；流式抗体Anti-Human CD11b PE(12-0118-42)购自eBioscience公司；RNA提取试剂盒(E.Z.N.A Total RNA kit I)购自OMEGA Bio-tek公司；cDNA反转录试剂盒(ReverTra Ace-α kit)和PCR定量荧光试剂(SYBRGreen Realtime PCR Master Mix)购自Toyobo公司；实验使用的引物均合成自生工生物。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及诱导分化

用6～8 mL RPMI-1640完全培养基将THP-1细胞悬浮在T25培养瓶中，并放置于37 ℃/5% CO2培养箱中培养，每2～3天向瓶中加入1～2 mL 新鲜培养基，当细胞密度达8×105～1×106cells/mL时进行传代。在筛选和优化PMA刺激时间时，用2 mL含有50 ng/mL PMA的RPMI-1640完全培养基将THP-1细胞以1×106cells/well 的密度接种于6孔板，分别诱导分化0、24、48、72 h，其中0 h为对照组。在筛选和优化PMA浓度时，在同一刺激时间下分别用2 mL含有0、25、50、75、100 ng/mL PMA的RPMI-1640完全培养基将THP-1细胞以1×106cells/well 的密度接种于6孔板，其中0 ng/mL为对照组。

1.2.2 细胞贴壁程度检测

将THP-1细胞以2.5×105cells/well 的密度接种于24孔板，用50 ng/mL PMA刺激0、24、48和72 h，或用0、25、50、75、100 ng/mL PMA刺激48 h或72 h，每组设置三个平行重复样品。在相应时间点弃去孔内的旧培养基，用DPBS洗细胞2次后，向每孔加入320 μL CCK-8工作液 (CCK-8:RPMI-1640=1:10)，置于37 ℃，5% CO2培养2 h。2 h后吸取24孔板每孔中的溶液分3次加入到96孔板的孔中，每孔加入100 μL。用酶标仪检测样品溶液在450 nm处的吸光值 (OD value)，以OD value来间接表征细胞的贴壁程度。

1.2.3 流式细胞分析

按照1.2.1所述方法在6孔板中将THP-1细胞诱导分化，每组设置三个平行重复，诱导完成后用细胞刮板将待测细胞轻轻刮下，800 r/min离心3 min后弃上清液，用DPBS将细胞洗3次，接着用1 mL 1% BSA-DPBS溶液将细胞重悬，在37 ℃，5% CO2培养箱中封闭30 min，800 r/min离心3 min弃去上清液，随后加入100 μL抗体工作液 (抗体：0.5% BSA-DPBS=5：95)，在4 ℃冰箱中避光孵育30 min，然后用DPBS将细胞洗1次，最后用600 μL DPBS重悬细胞，在流式细胞分析仪 (FACS AriaII,BD) 上进行检测，并利用FlowJo V10软件进行数据分析。

1.2.4 荧光定量PCR

按照1.2.1所述方法在6孔板中将THP-1细胞诱导分化，诱导完成后用RNA提取试剂盒提取待测细胞的总RNA，并用cDNA反转录试剂盒将待测细胞RNA反转录为cDNA。将待测样品加入384孔板中，每组设置三个复孔，在PCR仪 (7900 Real-time PCR system,Applied Biosystems) 中进行定量检测，反应程序设置为：1) 95 ℃ 1 min；2) 95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s进行40个循环；3) 95 ℃ 15 s；4) 60 ℃ 15 s。利用ΔΔCt法计算基因表达水平。实验使用的引物序列如表1所示。

1.2.5 统计学分析

所有统计数据均以平均值±标准差表示。采用Student’s t test对组间数据进行统计学分析，*P<0.05或**P<0.01时认为具有显著性差异，n.s.表示无显著性差异。

2 结果

2.1 PMA刺激时间和浓度对THP-1细胞形态和贴壁程度的影响

图1(a)显示，用50 ng/mL PMA刺激THP-1细胞时，THP-1细胞逐渐由悬浮的体积较小、透亮的圆形细胞变为贴壁的体积较大、中心较暗的圆形或椭圆形细胞，且贴壁细胞的体积随PMA刺激时间增加而增加。同时，从图1(b)可以看出，THP-1细胞的贴壁程度随PMA刺激时间增加而增加，但当刺激时间达到72 h时，THP-1细胞的贴壁程度与48 h时没有显著性差异，表明使用50 ng/mL PMA刺激48 h可诱导THP-1细胞全部贴壁，且当刺激时间延长至72 h时，已贴壁的细胞仍能稳定维持贴壁状态。图2(a)显示，当刺激时间为48 h时，75 ng/mL和100 ng/mL组的贴壁细胞数量明显更多，且细胞明显体积更大，但这两组细胞形态之间没有明显差异。此时，图2(b)显示THP-1细胞贴壁程度随着PMA浓度增加而增加，且当PMA浓度为100 ng/mL时，细胞贴壁程度最高。如图2(c)显示，当刺激时间为72 h时，各组贴壁细胞体积相比于48 h时均有所增大，且75 ng/mL和100 ng/mL组的贴壁细胞数量和细胞体积也相对更高，而这两组细胞形态之间仍没有明显差异。此时，图2(d)显示，当PMA浓度为75 ng/mL和100 ng/mL时，THP-1细胞贴壁程度均为最高，且二者之间没有显著性差异。

表1 荧光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qPCR

综合以上实验结果，在75 ng/mL 72 h或100 ng/mL 72 h PMA刺激下，THP-1细胞能达到最高的贴壁程度，且呈现良好M0型巨噬细胞形态，因此初步筛选72 h作为优化的刺激时间。但是，由于这两种PMA浓度对THP-1细胞的形态和贴壁程度的影响之间没有显著性差异，因此需进一步探究这两种PMA浓度对THP-1细胞中M0型巨噬细胞表面标志物以及M1和M2极化相关基因表达的影响，以筛选出二者之间更优的PMA浓度。

图1 PMA刺激时间对THP-1细胞形态和贴壁程度的影响Fig.1 Effects of PMA stimulation time on morphology and adherence of THP-1 cells

图2 PMA浓度对THP-1细胞形态和贴壁程度的影响Fig.2 Effects of PMA concentration on morphology and adherence of THP-1 cells

2.2 PMA浓度对M0型巨噬细胞表面标志物表达的影响

图3(a)-(b)显示，相比于正常THP-1细胞，用75 ng/mL和100 ng/mL PMA刺激72 h后THP-1细胞的大小和颗粒度明显增加，且M0型巨噬细胞表面标志物CD11b的表达量由15.6%±0.4%分别增加至73.8%±4.7%和83.2%±0.4%(P<0.01)，表明大部分THP-1细胞已被成功诱导分化为巨噬细胞，但两种PMA浓度对CD11b表达的影响之间没有显著性差异。同时，图3(c)显示，用75 ng/mL和100 ng/mL PMA刺激THP-1细胞72 h时，THP-1细胞中CD11b的基因表达分别上调至32.2±2.8倍(P<0.01) 和55.5±17.6倍(P<0.01)，但两种PMA浓度对CD11b基因表达的影响之间也没有显著性差异。

图3 PMA浓度对M0型巨噬细胞表面标志物CD11b表达的影响Fig.3 Effects of PMA concentration on the expression of M0 macrophage surface marker CD11b

2.3 PMA浓度对M1和M2型巨噬细胞标志基因表达的影响

图4显示，用75 ng/mL或100 ng/mL PMA诱导THP-1分化为M0型巨噬细胞时，均显著增强了M1型巨噬细胞标志基因IL-6、IL-1β、CD86以及M2型巨噬细胞标志基因IL-10、CD163、CD206的表达。其中，在75 ng/mL PMA刺激下，各基因表达的上调水平分别为IL-6(5.5±2.3倍)、IL-1β(273.2±3.3倍)、CD86(18.9±3.4倍)、IL-10(5.8±2.2倍)、CD163(258.5±13.0倍)、CD206(7.3±1.7倍)；在100 ng/mL PMA刺激下，各基因表达的上调水平分别为IL-6(8.7±1.6倍)、IL-1β(561.8±115.2倍)、CD86(24.6±0.8倍)、IL-10(12.9±1.6倍)、CD163(448.4.1.0±235.4.0倍)、CD206(10.9±1.3倍)，而100 ng/mL PMA刺激对IL-1β、CD86、IL-10和CD206的等基因表达的增强作用分别是75 ng/mL PMA作用效果的2.05±0.4倍、2.45±0.91倍、1.52±0.2倍和1.33±0.19倍。

图4 PMA浓度对THP-1细胞中M1和M2型巨噬细胞标志基因表达的影响Fig.4 Effects of PMA concentration on the gene expression of M1 and M2 macrophages markers in THP-1 cells

3 讨论

在设计开发具有良好免疫调节功能的组织修复生物活性材料的过程中，需要通过体外细胞实验来研究材料对巨噬细胞的影响及其调控机制，而尽管THP-1细胞已在体外研究中被广泛用于建立巨噬细胞模型，但标准化PMA诱导方案的缺乏不利于保证研究之间的一致性和可重复性，因此针对现有文献报道的PMA刺激条件进行比较和优化对建立有效、稳定的THP-1人源巨噬细胞模型至关重要。既往一些研究由于筛选PMA刺激条件的标准过于单一，例如仅根据THP-1细胞的贴壁程度和形态特征来选择优化的刺激条件[9]，其结果缺乏一定的说服力。Park等[6]曾较为系统地从细胞贴壁程度、表面标志物表达、细胞因子表达等多个方面对PMA浓度进行了优化，并提出使用5 ng/mL PMA刺激THP-1细胞48 h即可稳定地诱导其分化为巨噬细胞，但由于5 ng/mL PMA远低于大多文献报道的PMA浓度，并且有研究人员发现使用5 ng/mL PMA 刺激48 h后，仅能使约60%的THP-1细胞贴壁[10]，与Park等报道的90%贴壁率并不相符，因此本研究选择在目前报道较多的PMA浓度(25～100 ng/mL)和刺激时间(24～72 h)内通过比较分析不同PMA刺激条件对细胞形态、贴壁程度、M0型巨噬细胞表面标志物以及M1和M2型巨噬细胞标志基因表达的影响来对PMA刺激条件进行综合优化。研究结果显示，当PMA刺激时间为72 h，PMA浓度为75 ng/mL或100 ng/mL PMA时，THP-1细胞能够被诱导全部贴壁并呈现良好的M0型巨噬细胞形态，但75 ng/mL和100 ng/mL PMA会在诱导THP-1细胞分化为M0型巨噬细胞的同时显著增强细胞中M1型巨噬细胞标志基因IL-6、IL-1β和M2型巨噬细胞标志基因CD206的表达，且100 ng/mL PMA对IL-1β和CD206等基因表达的增强作用比75 ng/mL PMA更强，与前期研究报道的高浓度PMA能显著上调某些M1和M2型巨噬细胞相关基因表达的结果相似[6,10]。此外，本研究发现75 ng/mL和100 ng/mL PMA也能显著增强M1型巨噬细胞标志基因CD86和M2型巨噬细胞标志基因IL-10和CD163的表达。Park等[6]曾提出高浓度PMA刺激可能会造成某些基因过度上调，从而导致外部微弱刺激对巨噬细胞基因产生的影响被覆盖，而尽管本研究未对不同浓度PMA刺激引起的M1和M2型巨噬细胞标志基因表达上调是否会影响由于THP细胞分化而来的M0型巨噬细胞对炎症介质的响应进行更深入的探究，但实验结果也同样提示高浓度的PMA刺激可能会增加M0型巨噬细胞向M1或M2型巨噬细胞极化以及影响巨噬细胞对外部刺激响应的可能性。而考虑到在研究材料对巨噬细胞影响及其调控机制时，材料信号对巨噬细胞极化行为的影响是一项重要的研究内容，若巨噬细胞模型因受到过度PMA刺激而处于不同极化状态或无法准确响应材料信号刺激，可能会影响实验结果的准确性。因此，综合以上实验结果，在本研究比较分析的PMA刺激条件范围内，当PMA浓度为75 ng/mL，作用时间为72 h时，既能有效诱导THP-1细胞分化为M0型巨噬细胞，又能对THP-1细胞内M1和M2型巨噬细胞标志基因表达产生较低的上调作用，更适合作为诱导THP-1细胞分化为M0型巨噬细胞的PMA刺激条件。