胃癌患者血浆微小RNA-100表达水平及其临床意义*

张 铭，张新望，艾 静，张卫涛，魏益群，李 静

1.西安交通大学附属红会医院(西安 710054); 2.陕西省人民医院呼吸与危重症一科(西安 710068)；3.陕西省人民医院中医科(西安 710068)

胃癌是消化道肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，我国胃癌发病人数占世界胃癌新发病例数量的40%以上，发病率在我国各类恶性肿瘤中排名第二，死亡人数每年约有35万，占全部恶性肿瘤死亡人数的25%[1-2]。胃癌最大的特点是早期无明显症状或仅有上腹部不适、嗳气等非特异症状，容易被忽视，大部分患者就诊时已经发生转移因此早期诊断至关重要[3-4]。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR) 是一种非编码单链RNA分子，长度约为18～25 个核苷酸，不编码蛋白质，但可以发挥基因调控作用，研究发现其通过与靶基因 mRNA 的 3’端非编码区域结合进而抑制或降解靶基因mRNA的翻译而起效。大量研究证明miRNA 参与了细胞增殖、凋亡、分化等过程，在肿瘤发病机制中起着重要作用[5-9]，目前国内外研究发现多种miRNAs 在胃癌中表达异常。miR-100是属于miR-99家族成员之一，长度为22个核苷酸，大量研究发现miR-10在多种实体瘤和血液系统肿瘤中表达异常，在肿瘤中发挥促癌或抑癌作用，可以作为肿瘤诊断和预后的指标之一。国外研究发现miR-100在胃癌患者组织中的表达水平降低，有可能发挥抑癌作用，但机制尚不清楚[10-11]。随着检验技术的不断提高，国内外研究发现大多数循环中的miRNAs与肿瘤组织细胞内的miRNAs水平变化一致。循环中的miRNAs大多以核酸-蛋白复合物形式存在，能抵抗RNA酶的降解，具有高度稳定性。因此，循环中的miRNAs被认为是比较理想的标志物。为了探讨 miR-100在胃癌发生发展中的作用，本研究利用茎环逆转录聚合酶反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测正常对照及胃癌患者血浆中miR-100的水平，并进一步分析其与临床病理参数之间的关系。

资料与方法

1 一般资料 入选 2018年1月至2019年1月期间在西安交通大学医学部附属红会医院消化内科确诊的40例胃癌患者，其中男24例 ，女16例，年龄45～76岁，平均(62.80±16.13)岁 ，均为胃镜检查病理确诊病例。所有胃癌患者依据AJCC/UICC 胃癌 TNM 分期系统进行分期。选同期健康体检者40 例作为正常对照，其中男25例，女15例，年龄32～73岁，平均(53.16±14.72)岁。本研究得到西安交通大学医学部附属红会医院伦理委员会的批准及患者知情同意。

2 研究方法

2.1 血浆样本采集： 胃癌患者在手术或进行化疗、放疗等治疗前采集血样，清晨空腹状态下，采集胃癌患者和健康体检者外周静脉血5.0 ml，放入EDTA 抗凝管中待用。常温3000 r/min 离心10 min，取上清血浆放入无RNA酶的管中，4 ℃ 12000 r/min再次离心10 min，吸取上清至新的EP管中，分装后-80 ℃保存。

2.2 主要试剂与仪器： mirVanaTM miRNA RNA 提取试剂购自美国Ambion 公司，miScript Reverse Transcription试剂购自美国Ambion公司，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ购自德国Qiagen公司，Nondrop 2000 微量分光光度计为美国赛默飞公司产品，5804R型冷冻高速离心机为德国 Eppendorf 公司产品，实时荧光定量 PCR 仪为美国伯乐公司产品。

2.3 茎环RT-PCR检测血浆中miR-100的水平：采用mirVanaTM miRNA分离试剂盒提取血浆总RNA，操作严格按照说明书进行。利用微量分光光度计测量待定RNA样品的浓度及及纯度。根据文献[12]由上海生工公司分别合成miR-100 和内参照U6 的引物，利用逆转录试剂盒合成cDNA，逆转录反应条件为：37 ℃ 60 min ，95 ℃ 5 min ，cDNA于-20 ℃保存。采用茎环RT-PCR技术对miR-100进行扩增，PCR扩增条件为：95 ℃预变性 3 min，95 ℃ 5 s、61 ℃ 30 s 35个循环。

结 果

1 两组血浆中miR-100 水平的比较 采用茎环RT-PCR 方法检测胃癌组和正常对照组患者血浆中miR-100的水平，结果发现，正常对照组血浆中miR-100的水平为(0.58±0.18)，胃癌患者血浆中 miR-100 的水平为(0.35±0.21)，两组间的差异具有统计学意义(t= 6.375，P<0.01)。

2 miR-100 水平与胃癌临床病理参数间的关系 在不同年龄 、性别及肿瘤直径之间血浆miR -100水平的差异无统计学意义(P>0.05)，与无淋巴转移的胃癌患者相比，有淋巴转移的患者血浆中miR-100的水平明显降低(P<0.05 )；与无远处转移的胃癌患者相比，有远处转移的患者血浆中miR-100的水平明显降低(P<0.05 )。与Ⅰ/Ⅱ期胃癌患者相比，Ⅲ/Ⅳ期胃癌患者血浆中 miR-100的水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05 )，见表 1。

讨 论

胃癌是一种危害极大的常见消化系统恶性肿瘤，根据我国2015年癌症统计数据显示胃癌男性病死率排名第二，女性病死率排名第四。我国每年有46万新发胃癌患者，每年有35万人死于胃癌[2]。由于胃癌早期症状不明显，有超过90%的患者是疾病发展到中晚期才到医院就医诊断的，他们中的80%达不到5年生存率。因此，对于胃癌的防治关键是早期发现、早期诊断、早期治疗，其中早期诊断就显得至关重要。早在1993年，国外研究人员意外的在线虫体内发现一种RNA分子，它的长度为22个核苷酸。令人惊奇的是，尽管它们不能编码蛋白，但是它们却可以控制线虫细胞发育，由此引发了miRNA的研究序幕[5]。miRNA的表达具有高度保守性、组织特异性及时序特异性。研究证实miRNA不但参与个体发育，而且还在细胞增殖、凋亡、分化等过程中起重要作用。

表1 miR-100水平与胃癌临床病理参数间的关系

国内外学者研究发现在胃癌组织中多种miRNAs表达水平异常，miRNAs在胃癌的发生、发展、侵袭以及转移过程中发挥重要作用[10-11]。虽然机制尚不是十分清楚，但根据其在胃癌中的作用分为促癌和抑癌miRNA两大类，前者一般在胃癌组织中表达升高，主要功能是抑制细胞凋亡，进而促进胃癌细胞增殖、侵袭以及远处转移；后者一般在胃癌组织中表达降低，主要功能是促进细胞凋亡，进而抑制胃癌细胞增殖、侵袭以及远处转移。miR-100是2002年由Mourelatos等发现的一种miRNA，属于miR-99家族成员之一。国内外多项研究发现miR-100可能是肺癌、肝癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、肾细胞癌、宫颈癌、膀胱癌等肿瘤预后的一个指标[13-18]。目前关于miR-100与胃癌发病机制的研究文献多集中于报道其在胃癌组织内的表达水平，研究发现与癌旁组织相比，miR-100在胃癌组织中的表达水平明显降低，进一步分析发现miR-100的水平与肿瘤组织的大小、是否发生远处转移等密切相关，推测miR-100在胃癌发病中可能发挥了抑癌机制。国内学者近几年对于miR-100和胃癌的发病机制研究也取得了一些进展，发现胃癌组织中miR-100的表达水平低于胃癌癌旁组织，并且与肿瘤分化程度、淋巴结转移、远处转移以及TNM分期有关[19-20]。

循环中的miRNAs大多以核酸-蛋白复合物形式存在，能抵抗RNA酶的降解，具有高度稳定性，外周血取材容易，因此外周血miR-100的检测可能成为一个新的胃癌诊断血清学指标。本研究通过茎环RT-PCR方法检测血浆中miR-100表达水平，结果发现血浆中miR-100的水平在胃癌患者中比对照组显著降低(P<0.01)，血浆中miRNA-100的水平与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤大小均无显著相关(P>0.05)，而与淋巴结转移、远处转移以及肿瘤TNM分期等临床病理特征有关(P<0.05)，但检测结果并没有发现miR-100的表达水平与肿瘤组织的直径有关，这可能与病例选择、直径测量误差等因素等有关。

综合我们以及国内外研究结果提示:miR-100可能参与了胃癌的发生、发展过程，有可能成为胃癌早期诊断及治疗、评估胃癌预后新的指标。但由于样本的限制，应进一步扩大样本量，增加检测时间段，动态监测胃癌患者血浆中miR-100的水平，观察其在胃癌术前、术后不同时间段的表达变化，对所有患者进行术后跟踪随访，根据预后资料进一步验证分析miR-100在胃癌发生发展中的功能和作用机制。