啤酒花挥发油成分及其杀螨活性分析

赵娜娜，傅文佳，路 伟，古丽米热，杜书亚

(新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】啤酒花HumuluslupulusL. 是桑科葎草属一种多年生攀援草本植物，原产于欧洲、美洲和亚洲地区。中国新疆和四川北部均有野生资源分布，各地多有栽培，是酿造啤酒的原料，在啤酒酿造中，啤酒花具有不可替代的作用；除此之外，啤酒花还具有抗肿瘤、防治骨质疏松症和抗氧化等功能[1]；目前对其杀虫活性研究，仅有国外研究证明啤酒花超临界CO2萃取物对3种仓储害虫谷象、杂拟谷盗和谷斑皮蠹具有拒食活性，表明啤酒花萃取物是可以作为防治仓储害虫的一种潜在拒食剂[2]。啤酒花具有开发为天然植物源农药的潜力。土耳其斯坦叶螨是危害棉花、玉米、果树、蔬菜等多种农作物的重要害螨[3-7]，在中国仅分布于新疆地区[8-11]，在新疆地区普遍发生，是北疆棉花害螨的优势种群，给棉花生产带来很大的影响[12, 13]。目前国内外防治土耳其斯坦叶螨的主要手段依然是化学防治，但是高毒高残留农药的不合理选择和使用，对环境和生态造成污染和危害[14]。且由于土耳其斯坦叶螨繁殖速率快、世代周期短，短期内对一些常用杀虫剂可以产生强抗性，给防治带来了很大的挑战，也成为制约新疆农业生产发展的关键因子[15]。筛选出高效、低毒、对环境友好的新型生物农药势在必行。研究生物杀螨剂对棉叶螨的防治效果和毒力，对棉田杀螨剂的合理使用具有指导意义[16]。【前人研究进展】植物源农药是一类来源于植物体的农药，其有效成分通常不是单一化合物，而是植物有机体中的一些、甚至大部分有机物质。因其具有环境友好、对非靶标生物安全、不易产生抗药性、作用方式特异、促进作物生长并提高抗病性、种类多、开发途径多等特点，在瓜、果、蔬菜、特种作物(茶、桑、中草药、花卉等)及有机农业领域得到了广泛关注和应用[17]。黄花蒿、姜黄、丁香、青蒿、侧柏叶、羊蹄根、地锦、石榴籽、木鳖子、大山芝麻、沙茴香、盐肤木、艾蒿、牵牛子、牛至子等多种植物对朱砂叶螨具有生物活性[18-33]；白花丹、紫茎泽兰、藿香、北细辛等植物对柑桔全爪螨具有较好的生物活性[34，35]；狼毒、苦参、百部、臭椿等植物对二斑叶螨具有生物活性[36]；紫丁香、黄连木、盐肤木、南方六道木、沙茴香和水芹等对酢浆草如叶螨具有较好的毒杀作用[37]；核桃青皮、火炬树、河朔荛花对山楂叶螨具有生物活性[38-40]。【本研究切入点】已有的研究报道明确了从植物中可以获得比较理想的杀螨活性物质，为研究开发植物性的杀螨剂奠定了一定的基础。国内外已报道了多种植物具有防治叶螨的作用，然而利用植物源提取物防治土耳其斯坦叶螨的相关研究还较少。研究啤酒花挥发油成分及其杀螨活性。【拟解决的关键问题】研究4种植物精油对土耳其斯坦叶螨的杀螨活性，通过水蒸气蒸馏法提取4种植物精油，叶片浸渍法测定不同植物精油对土耳其斯坦叶螨的毒力，评价不同精油对土耳其斯坦叶螨的触杀活性，为植物源杀螨剂的开发和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 植物

选用4种具有生物活性的植物作为研究材料，啤酒花、香青兰、驱虫斑鸠菊、欧洲鳞毛蕨均采自新疆维吾尔自治区。所有植物标本保存于新疆农业大学农学院昆虫系天然产物与化学生物学实验室。表1

表1 4种植物名录Table 1 Four plants directory

1.1.2 供试虫源

土耳其斯坦叶螨于2017年6月采自新疆沙湾县棉花田的自然种群，采集前棉田未施用任何药剂。将采集的棉叶螨接到室内种植的盆栽辣椒上，饲养多代后再挑选同一批次、大小一致的成螨作为试螨，试螨不分雌雄。

饲养条件：接种后的盆栽棉花置于人工气候箱内，气候箱设置温度26～28°C，相对湿度为75%，光照黑暗时间为14 h∶8 h (L∶ D)。

1.1.3 试剂与仪器

仪器：连续蒸馏装置，北京玻璃仪器厂；

SHZ-DIII循环水式真空泵：巩义市英峪予华仪器有限责任公司；

RE-52CS型号旋转蒸发器：上海振捷实验设备有限公司；

数控升降式水浴锅：上海振捷实验设备有限公司；

电子天平：天马衡基FA1004；

恒温恒湿培养箱：宁波莱福科技有限公司；

培养板：12孔细胞培养板。

试剂：正己烷(分析纯)、丙酮、无水硫酸钠：国药集团化学试剂北京有限公司；

聚四氟乙烯：上海三爱富有限责任公司。

1.2 方 法

1.2.1 水蒸气蒸馏法提取植物精油

通过水蒸气蒸馏法提取欧洲鳞毛蕨、啤酒花、香青兰、驱虫斑鸠菊4种植物的精油。将0.5 kg晒干的植物放入到3 000 mL的圆底烧瓶，对水2 000 mL，用水蒸气蒸馏法蒸馏3～4 h，所得油水混合物用正己烷萃取，萃取所得物用无水硫酸钠脱水后，用旋转蒸发器减压蒸发浓缩(40℃)回收正己烷，所得残留的油状液即为精油，测比重，收集放入棕色瓶中密封保存，置于4℃冰箱中备用。

1.2.2 触杀活性测定

生测方法结合参考FAO叶片浸渍法做了一些改进，配制浓度为2%的琼脂，将加热后的琼脂倒入12孔的培养板内，琼脂高度约为0.5 cm，置于-4℃冰箱内备用。将田间采集未施药剂的新鲜棉花叶片洗净晾干，用直径为2 cm的打孔器打孔待备用；以丙酮为溶剂配制4 mL的药剂，棉花叶片在溶液中浸泡10 s后，用镊子夹出，置于滤纸上自然挥发2 min，然后叶背朝上置于已倒好的琼脂上，挑取10头健康一致的成螨于叶片上，宣纸盖在培养板上，固体胶封好，置于温度为25℃、湿度为70%的温箱内。24 h后，观察和记录试螨的死亡情况。每个浓度重复5次，每个重复10头试螨，丙酮不加药剂作为空白对照。用毛笔拨动螨体，螨体不动即为死亡。

死亡率(%)=100×死螨数/试螨数；

校正死亡率(%)=100×[处理组死亡率-对照组死亡率/(1-对照组死亡率)]；

半致死浓度(LC50)即引起50%土耳其斯坦叶螨死亡率的浓度，使用Probit软件包计算得到半致死浓度。

1.2.3 GC-MS测定精油化学成分

样品送至北京师范大学分析测试中心。

采用美国Bruker公司450GC-320MS三重四级杆气质联用仪，配备BP-5MS石英毛细管色谱柱(0.25 μm×0.25 mm×30 m)。EI离子源温度210℃；传输线温度250℃；进样口温度250℃；进样量1 μL，分流比1∶10。升温程序：起始温度50℃，停留5 min，之后以10℃/min的速率升温至290℃，停留15 min。

2 结果与分析

2.1 生物活性

研究表明，在药剂浓度为60.00 mg/mL时，啤酒花精油的致死率高达100.00%，香青兰致死率84.00%，驱虫斑鸠菊、欧洲鳞毛蕨的致死率分别为48.00%、40.00%；在浓度为40 mg/mL时，啤酒花精油的致死率高达96.00%，香青兰精油的致死率分别为78.00%，驱虫斑鸠菊的致死率为38.00%，欧洲鳞毛蕨的致死率为8.00%；在浓度为26.70 mg/mL时，啤酒花的致死率高达88.00%，香青兰的致死率为54.00%，驱虫斑鸠菊的致死率为28.00%，欧洲鳞毛蕨无活性；在浓度为18.30 mg/mL时，啤酒花精油的致死率仍然高达70.00%，香青兰、驱虫斑鸠菊的致死率分别为26.00%、16.00%；在浓度为11.70 mg/mL时，各植物精油的活性均减弱甚至无活性，活性较好的为啤酒花精油，致死率36.00%；在浓度为8.00 mg/mL时，仅有啤酒花有较弱活性，致死率为24.00%。表2

表2 土耳其斯坦叶螨经4种精油处理24 h后校正死亡率Table 2 Correct mortality of the 4 essential oils against T. turkestani adults after 24 h(%)

注：数据为平均值±标准误，不同小字母表示0.05水平上差异显著
Note：Data were presented as mean±SD, data with different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level

研究表明，啤酒花、香青兰精油对土耳其斯坦叶螨的触杀活性较好，LC50分别为13.30、126.28(mg/mL)，驱虫斑鸠菊精油的触杀活性较弱，LC50为47.50 mg/mL，活性最差的是欧洲鳞毛蕨精油，LC50为83.09 mg/mL。表3

表3 4种精油对土耳其斯坦叶螨的触杀活性Table 3 Contact toxicity of the 4 essential oils against T. turkestani adults

2.2 啤酒花精油的化学成分

啤酒花精油通过GC-MS检测并鉴定出48个峰，其中出峰时间在20.228 min时的物质含量最高。图1

图1 啤酒花精油离子谱
Fig. 1 Total ion chromatogram of the essential oil fromH.lupulus

通过分析鉴定出啤酒花精油化学成分中大于1%的有28个化合物，如表4。主要成分为1a, 2, 5, 5-四甲基-反式-1a, 4a, 5, 6, 7, 8-六氢-γ-铬烯(17.15%)、(S, E)-3, 7, 11-三甲基-6, 10-十二碳二烯酸甲酯(8.26%)、石竹烯氧化物(7.99%)等。图1,表4

3 讨 论

室内毒力测定结果表明，土耳其斯坦叶螨对啤酒花精油很敏感，其LC50值为13.30 mg/mL；将各精油按毒力大小排序依次为：啤酒花、香青兰、驱虫斑鸠菊、欧洲鳞毛蕨。啤酒花精油经GC-MS鉴定，主要成分为1a, 2, 5, 5-四甲基-反式-1a, 4a, 5, 6, 7, 8-六氢-γ-铬烯(17.15%)、(S, E)-3, 7, 11-三甲基-6, 10-十二碳二烯酸甲酯(8.26%)、石竹烯氧化物(7.99%)，这3种化学成分很有可能是其关键活性成分，但还有待下一步分离纯化、生物测定验证。

目前研究多关注啤酒花在酿酒方面的作用，鲜有其杀虫杀螨活性报道。国内仅有1篇文献涉及植物精油对土耳其斯坦叶螨的生物活性[41]，其他大都集中在朱砂叶螨、二斑叶螨的生物活性研究方面；有文献报道迷迭香、薄荷等精油及其主要化学成分对土耳其斯坦叶螨的熏蒸活性[42]。有必要进一步开发植物资源，为土耳其斯坦叶螨的生物防除提供理论依据；进行生物活性测定以及杀螨活性物质的分离、鉴定，为植物源杀螨剂的研制提供技术数据。杀螨植物中的活性物质一般可以直接利用，也可以通过分离纯化活性植物确定关键活性成分，关键活性成分的确定可为农药成分的合成提供先导结构，新的功能集团可延缓降低害螨的抗性发展，对活性成分进行修饰合成，为进一步研制杀螨农药新品种奠定理论基础。如以姜黄素为原料合成了1种苯腙类姜黄素衍生物，结果表明，姜黄素及其衍生物对柑桔全爪螨、朱砂叶螨、腐食酪螨都有不同程度的触杀作用[43]。但是，目前对杀螨植物中活性成分分离鉴定的研究仍较少，大都集中在对杀螨植物的筛选与生物活性测定上。研究接下来要对啤酒花精油进行分离纯化，以生物活性为指导进行硅胶柱层析分离，并结合核磁共振技术、质谱技术等确定活性成分的化学结构。

表4 啤酒花精油化学成分(>1%)Table 4 Chemical compositions of the essential oil from H. lupulus (>1%)

在试验中还发现各精油的杀螨活性与杀虫活性并不一致，如杀螨活性最好的植物是啤酒花，而杀嗜卷书虱活性最好的是椒蒿、驱避赤拟谷盗活性最好的植物却是香青兰，这可能与昆虫和螨具有不同的生理构造有关，也与生物测定的方法有关，对叶螨活性好的植物对昆虫的活性不一定好，不同的昆虫活性也不一定一致，在筛选农药活性化合物时, 不能一味单调的追求针对某一昆虫的杀虫效果或杀螨效果，而应该综合测试植物提取物或活性化合物对不同靶标生物的活性。

4 结 论

4种参试植物中，啤酒花、香青兰、驱虫斑鸠菊精油对土耳其斯坦叶螨具有较好的触杀活性，其中啤酒花精油的活性最好，有发展为天然杀螨剂的潜力。啤酒花精油通过气相色谱-质谱联用仪分析，主要成分为1a, 2, 5, 5-四甲基-反式-1a, 4a, 5, 6, 7, 8-六氢-γ-铬烯(17.15%)、(S, E)-3, 7, 11-三甲基-6, 10-十二碳二烯酸甲酯(8.26%)、石竹烯氧化物(7.99%)，3种化合物都有可能是活性化合物。