复方金连菊制剂对PRRSV、TGEV 体外作用的研究

黄仕千 农扬 杨昭远 张鑫 俸祥仁 刘伟

（1，广西百色市田阳区那满镇水产畜牧兽医站 533600；2，广西壮族自治区动物卫生监督所 530001；3，广西南宁市江南区动物卫生监督所 530000；4，广西南宁市动物园 530000；5，广西南宁强微农牧科技有限公司 530001；6，广西壮族自治区兽医研究所 530001）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS） 由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV） 引起的一种急性接触性传染病，主要引起妊娠母猪的繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状[1,2]。猪传染性胃肠炎是由冠状病毒科冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV） 引起的一种急性、高度接触性肠道传染病，以呕吐、严重腹泻、脱水、2 周龄内仔猪高死亡率为特征，通常死于脱水和电解质代谢紊乱[3]。目前，猪繁殖与呼吸综合征和猪传染性胃肠炎两种病毒性疾病在我国广泛存在，给养殖业造成了极大的危害。本试验通过对复方金连菊中药溶液体外抑制PRRSV、TGEV 的活性进行初步研究，旨在为临床上控制两种疫病提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药物

复方金连菊中药溶液由广西南宁强微农牧科技有限公司与广西壮族自治区兽医研究所联合研制[4,5]，规格： 1g 原药材/ml。

1.1.2 毒株、细胞

PRRSV，Marc-145 传代细胞，PK-15 传代细胞，TGEV 均为广西壮族自治区兽医研究所病毒研究室提供。

1.1.3 主要试剂

DMEM培养基、1640培养基、小牛血清、胰蛋白酶（0.25%）、NaHCO3、双抗（青霉素80 万单位、链霉素80 单位）

1.2 方法

（1） PRRSV、TGEV 病毒毒力测定（TCID50）。按殷震[6]方法、冯晓巍[3]方法将Marc-145 传代细胞进行消化传代，细胞数调整至2×105个/ml，加到96 孔细胞培养板中，100ul/孔，置于5%CO2的37℃培养箱中培养，待细胞长成单层后，接种用DMEM 细胞维持液稀释的浓度分别为10-1～10-12 的PRRSV病毒液，100ul/孔，每个稀释度接种5 孔，5%CO2的37℃培养箱中培养96h，每天观察CPE 产生情况。

将PK-15 传代细胞同上述方法进行，待细胞长成单层后，接种用1640 细胞维持液稀释的浓度分别为10-1～10-12的PRRSV病毒液。按Reed-Muench 公式计算TCID50[7-9]。

（2） 对Marc-145 传代细胞，PK-15 传代细胞安全浓度的测定。按冯晓巍[3]方法取对数生长期的细胞株，细胞数调整为2×105个/ml，加入96 孔板中，100ul/孔。置于5%CO2培养箱中37℃，待贴壁长成单层后将药液用2%DMEM 细胞维持液连续的倍比稀释后，加到已长成单层的96 孔细胞培养板上，药液浓度见表1。并设正常细胞对照组，每个浓度重复5 孔，置于37℃5%CO2培养箱中培养，每天观察CPE 情况，96h 后弃培养液上清部分，每孔加入含5mg/ml 噻唑蓝（MTT） 的2%DMEM 细胞维持液30ul，继续培养4h 后，弃MTT 上清，每孔加溶解液二甲基亚砜（DMSO） 100ul，室温震荡10min 使结晶物溶解，然后用酶联免疫吸附法检测仪在570nm 波长处测定吸光度值。

对PRRSV、TGEV 的阻断作用测定。按冯晓巍[3]方法将药液用2%DMEM （TGEV 用10%和2%1640） 细胞维持液作连续的倍比稀释的药液浓度，分别加到长满单层Marc-145 传代细胞的96 孔细胞培养板上，100ul/孔，每个稀释度重复5 孔。37℃作用4h，弃去药液，每个孔加入100TCID50病毒液，100ul/孔，另设细胞对照组和病毒对照组。5%CO2培养箱中37℃培养，每天观察CPE，当病毒CPE 达到“+++或++++” 时，按MTT 吸收法用酶联免疫检测仪在570nm 波长处测定各孔吸光度值（OD570）。

对PRRSV、TGEV 的抑制作用测定。按冯晓巍[3]方法将100TCID50病毒液接种至长成单层Marc-145 传代细胞的96 孔细胞培养板上，100ul/孔，37℃吸附2h，弃去病毒液，加入2%DMEM （TGEV 用10%和2%1640） 细胞维持液作连续的倍比稀释的药液浓度，100ul/孔，每个稀释度重复5 孔，另设细胞对照和病毒对照。5%CO2培养箱中37℃培养，每天观察CPE，当病毒CPE 达到“+++或++++” 时，按MTT 吸收法用酶联免疫检测仪在570nm 波长处测定各孔吸光度值。

表1 中药提取物抑菌浓度与对应的药物稀释倍数关系

对PRRSV、TGEV 的直接杀灭作用测定。按冯晓巍[3]方法将各个稀释度的药液分别与等体积100TCID50病毒液混合，37℃作用2h，加到长成单层Marc-145 的96 孔细胞培养板上，100ul/孔，每个稀释度重复5 孔，另设细胞对照和病毒对照。5%CO2培养箱中37℃培养，每天观察CPE，当病毒CPE 达到“+++或++++” 时，按MTT 吸收法用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定各孔吸光度值。

1.3 药物对抗病毒感染细胞的指标计算

细胞存活率（%）=药物组OD570/正常细胞组OD570×100

抑制率（%）=（药物组OD570-病毒对照组OD570）/病毒对照组OD570×100

1.4 统计分析

试验数据采用Excel 2007 进行整理，用DPS 进行单因素方差分析，并以Duncan's 法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 PRRSV、TGEV 病毒毒力测定（TCID50）

经实验测得PRRSV 的病毒毒力（TCID50） 为10.05.5/0.1ml，TGEV 病毒毒力为10.05.25/0.1ml。以下病毒接种量均为100TCID50。

2.2 复方金连菊中药制剂对Marc-145 传代细胞，PK-15 传代细胞的安全浓度0D570 值

由表2 可知，根据MTT 法测得复方金连菊中药的药液浓度为62.5mg/ml 时与正常细胞对照组OD570值相近，且相比较差异不显著（P＞0.05）。复方金连菊中药的药液浓度为31.25mg/ml、15.625mg/ml、7.8125mg/ml 和3.90625mg/ml 时OD570值与正常细胞对照组相近，且相比较差异不显著（P＞0.05）。比较复方金连菊中药制剂对Marc-145 传代细胞和PK-15 传代细胞的OD570值与正常细胞对照组最相近者为最大安全浓度即62.5mg/ml、31.25mg/ml。

2.3 复方金连菊中药制剂对PRRSV、TGEV 感染细胞的阻断作用

表2 复方中草药制剂对Marc-145 细胞、PK15 细胞的安全浓度

由表3 可知，复方金连菊中药制剂的药液浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.625 和7.8125mg/ml 各孔吸光度值（OD570） 与正常细胞对照组吸光度值（OD570）、病毒对照组吸光度值（OD570） 相比较差异极显著（P＜0.01）；说明药液浓度为500mg/ml～7.8125mg/ml 对PRRSV、TGEV 感染细胞的阻断作用显著。

药液浓度为3.90625mg/ml 的吸光度值（OD570） 与正常细胞对照组相比较差异极显著（P＜0.01），与病毒对照组相比较差异不显著（P＞0.05）；说明药液浓度为3.90625mg/ml 对PRRSV、TGEV 感染细胞的阻断作用不显著。

由表4 可知，复方金连菊中药制剂的药液浓度为500、250、125、62.5、31.25 和15.625mg/ml 各孔吸光度值（OD570）与正常细胞对照组吸光度值（OD570）、病毒对照组吸光度值（OD570） 相比较差异极显著（P＜0.01）；说明药液浓度为500～15.625mg/ml 对PRRSV、TGEV 感染细胞的阻断作用显著。药液浓度为7.8125 和3.90625mg/ml 的吸光度值（OD570） 与正常细胞对照组相比较差异极显著（P＜0.01），与病毒对照组相比较差异不显著（P＞0.05），说明药液浓度为7.8125 和3.90625mg/ml对PRRSV、TGEV 感染细胞的阻断作用不显著。

2.4 复方金连菊中药制剂对PRRSV、TGEV 增殖的抑制作用

由表3 可知，复方金连菊中药制剂溶液浓度为500、250、125、62.5、31.25 和15.625mg/ml 对PRRSV 在Marc-145 传代细胞上的增殖具有极显著的抑制作用（P＜0.01），药液浓度为3.90625mg/ml 对PRRSV 在Marc-145 传代细胞上的增殖具有显著的抑制作用（P＜0.05）。

由表4 可知，复方金连菊中药制剂溶液浓度为500、250、125 和62.5mg/ml 对TGEV 在PK-15 传代细胞上的增殖具有极显著的抑制作用 （P＜0.01）；药液浓度为31.25、15.625、7.8125 和3.90625mg/ml TGEV 在PK-15 传代细胞上的增殖具有显著的抑制作用（P＜0.05）。

表3 复方中草药制剂对PRRSV 的体外作用

表4 复方中草药制剂对TGEV 的体外作用

2.5 复方金连菊中药制剂对PRRSV、TGEV 的直接杀灭作用

由表3 可知，药液浓度在500～3.90625mg/ml 范围内对PRRSV 具有极显著的直接杀灭作用（P＜0.01）。

由表4 可知，药液浓度在500～62.5mg/ml 范围内对TGEV具有极显著的直接杀灭作用（P＜0.01）；药液浓度在31.25～3.90625mg/ml 范围内能够影响TGEV 对细胞的作用，但效果不明显（P＞0.05）。

3 结论与讨论

利用合适的病毒-细胞培养体系，采用MTT 法考察测试药物对病毒增殖的影响，是常用体外筛选抗病毒药物的手段之一。本试验结果为复方金连菊中药制剂体外抗PRRSV、TGEV活性提供了有力证据。试验所用细胞均为8～14 代的细胞，病毒是在细胞中增殖的第二代病毒，以避免细胞和病毒的差异对结果的影响。

药物抗病毒的作用机理，一般认为是对途经的，但主要有2 条途径，一是直接杀灭病毒，二是抑制病毒的繁殖。本试验目的是观察样品能否进入细胞或吸附细胞表面以阻止病毒的吸附和进入。试验结果显示： 复方金连菊中药制剂溶液对Marc-145 细胞的最大浓度为62.5mg/ml，对PK15 细胞的最大浓度为31.25mg/ml，在安全浓度以下不明显引起细胞损伤，对细胞无毒性作用。复方金连菊中药制剂溶液浓度为500～7.8125mg/ml对PRRSV 感染细胞的阻断作用极为显著（P＜0.01），药液浓度为3.90625mg/ml 对PRRSV 感染细胞的阻断作用不明显 （P＞0.05）；药液浓度为500～15.625mg/ml 对TGEV 感染细胞的阻断作用极为显著 （P＜0.01），药液浓度7.8125～3.90625mg/ml 对TGEV 感染细胞的阻断作用不明显（P＞0.05）；说明药液浓度高于15.625mg/ml 分别能对抑制PRRSV 与Marc-145 传代细胞和TGEV 与PK-15 传代细胞的吸附、融合，从而阻止病毒的吸附和进入。复方金连菊中药制剂溶液浓度在500～3.90625mg/ml 范围内对PRRSV 具有极显著的直接杀灭作用（P＜0.01），药液浓度在500～62.5mg/ml 范围内对TGEV 具有极显著的直接杀灭作用（P＜0.01）。说明复方金连菊中药制剂具有一定的阻止病毒的吸附和进入效果，但具体应用尚需进一步临床试验。