环境响应性自组装多肽水凝胶的研究进展

戴江东

（建湖县人民医院门诊中药房，江苏盐城 224700）

0 引言

水凝胶是一种由物理或化学方式相互交联且在水中可以发生膨胀的三维网络体系。在20世纪50年代末，Wichterle和Lim首次合成了聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）水凝胶，自此之后，由不同结构和不同理化性质的天然或合成聚合物所制备的水凝胶被广泛应用于药物递送系统［1］。环境响应性水凝胶是其中一类能够对环境刺激做出相应变化的新型水凝胶，即当受到外界一些物理或化学条件的刺激时，凝胶会发生溶胀、收缩、降解或是从凝胶向溶胶转换等变化［2］。环境响应性水凝胶不但具有良好的吸水性、保水性以及可降解性等传统水凝胶的特点外，还具有优良的控释性、生物相容性、生物黏附及环境敏感性等优点，从而在各个领域有着广泛的应用，是一类极具开发潜力的高分子材料［3-4］。

环境响应性多肽水凝胶，因为其可降解性、生物相容性及合成的多样性等优点在药物研究领域有着广泛的应用。本文着重从环境响应性、自主装多肽以及凝胶形成机制这3个方面进行介绍。

1 环境响应性

环境响应性水凝胶根据其环境响应性主要分为pH响应性、温度响应性、光响应性、氧化还原响应性等［5］。

1.1 pH响应性水凝胶

具有pH敏感的水凝胶可以对不同的pH值产生不同的反应，这一特点常被应用于药物递送系统中。蛋白和多糖类生物物质是较常用的pH响应性水凝胶材料，如提取于阔荚合欢种子的水溶性多糖（Polysaccharides of Albizia lebbeck L，ALPS）是一种非离子多糖，可用于制备pH敏感的药物递送材料［6］。Qu等［7］将n-羧乙基壳聚糖（CEC）添加至聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）中形成可用于包裹阿霉素（DOX）的具有抗肿瘤活性的水凝胶体系，且CEC与PEGDA均具水溶性，因而在制剂制备工艺中无须釆用有机溶剂。与传统制剂相比，该包裹DOX的半固体水凝胶制剂具有良好的可注射性与pH响应性，当注射入肿瘤部位后，在肿瘤微环境的刺激下持续缓慢地释放出抗肿瘤药物并减少不良反应，在药物递送领域具有良好的应用前景。

1.2 温度响应性水凝胶

温度响应性水凝胶能在温度改变时产生相应的溶胀、收缩或降解等行为。在过去的10年里，可注射的温敏材料已经被研究用于修复各种病变的器官、组织及细胞等，如一些温敏聚合物材料被以微创的方式注射入体内，受到温度变化的刺激时，可以通过几种非共价的连接，诱导聚合物链之间的可逆交联，从而发挥对环境变化的响应作用。Wu等［8］用聚乙二醇和聚磷酸乙酯组成的三嵌段共聚物制备成可以包载抗肿瘤药物DOX的温敏纳米水凝胶，通过非小细胞肺癌细胞（A549）对DOX的摄取实验发现，该载药的纳米水凝胶的细胞摄取率较高，细胞毒性较强，说明该温度敏感型水凝胶是较好的药物递送材料。

1.3 光响应性水凝胶

温度与pH由于其生理意义，是较重要的外部刺激因素，因此温敏型和pH敏感型的水凝胶被研究得较多，但是近年来，光敏型水凝胶所受的关注度越来越高。与传统的交联诱导方式不同，紫外线照射可以进行原位聚合，用于制造具有明确网络和弹性的水凝胶材料，能够达到时间以及空间上的精准控制［9-10］。Haines［11］团队研究的改性多肽就是用这种方法所合成的，该多肽在正常情况下二级结构呈线性，受到一定程度的紫外线照射时发生自组装最终形成具有内部β-发夹结构的水凝胶。

1.4 氧化还原响应性水凝胶

由氧化还原条件刺激而响应的水凝胶是一类较新的环境响应性水凝胶，在受到氧化或是还原条件改变的刺激时，该类凝胶的氧化还原中心发生改变，且这种改变通常是可逆的。根据水凝胶分子氧化还原中心的不同，可将该类环境响应性水凝胶分为二硫类、共轭聚合物类、二茂铁类、过渡金属类以及四硫富瓦烯类。由于生物体中的微环境也具有一定的氧化还原特性，所以该类水凝胶在生物医药领域具有较大的应用前景［12］。Gao等［13］研制出一种基于透明质酸（HA）的还原敏感性水凝胶，该凝胶以氨基乙基二硫化物（AED）作为交联剂，对伤口等微环境中的谷胱甘肽（GSH）浓度变化敏感。GSH可与ADE反应导致凝胶网络的裂解，水凝胶产生膨胀等清晰可见的变化，因此可用于伤口修复及组织再生支架等领域。

2 自组装多肽

多肽作为一种自然界中普遍存在的生物物质，在许多领域都有着广泛的应用，如在农业中可用作杀虫剂，在医学中可用作抗菌药物以及作为药物化学中的一些激素类成分。自组装多肽是一类特殊的多肽，其能够在特定的条件下利用分子间的各种非共价作用力来形成纳米级的纤维、囊泡、纳米管或纳米球等具有高度有序内部结构的多肽分子［14］。自组装多肽因为其具有低免疫反应、低毒性、生物利用度高、易于制备改造以及生物相容性好等优点在近年来备受生物医药领域的关注（如图1所示）［15］。

图 自组装多肽在医药领域中应用

2.1 抗菌药物

研究表明，当氨基酸数量少于20的短肽序列中包含阳离子残基时，该短肽具有一定的抗菌活性，尤其是当肽链中富含精氨酸时，多肽的抗菌活性较明显且这一特性已被广泛应用。例如从果蝇触角状体蛋白中提取的一种由16个氨基酸组成的穿透蛋白就具有较好的抗菌活性。另一种具有抗菌活性的自组装多肽为HIV-1的转录反式激活因子（TAT）［16］。TAT多肽是由11个氨基酸组成的短肽，因为其氨基酸序列中包含6个精氨酸和2个赖氨酸，所以整个肽序的碱性非常强。研究表明，当TAT中任何一个碱性氨基酸被替换为中性氨基酸时，它的抗菌活性都会减弱，这是由于精氨酸的存在可以与细胞膜相互作用导致细胞泄漏从而发挥抗菌作用。

Dehsorkhi等［17］在研究由6个连续的丙氨酸和精氨酸组成的阳离子短肽与1，2-二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）的相互作用时发现该阳离子短肽具有抗菌的功能。具有抗菌特性的A6R多肽能够在低浓度下自组装成片状结构，在浓度升高后，该阳离子短肽可以形成纳米管结构且在与DPPC脂质囊泡共存时，A6R的β-折叠被破坏，与囊泡表面的双层DPPC产生相互作用，在不会破坏囊泡本身的情况下产生抗菌活性。

Daphne等［18］研究出一种基于多肽的抗菌水凝胶，该多肽MARG1含有20个氨基酸残基，当用水作溶剂时，由于带正电荷的侧链间的电荷排斥作用（精氨酸与赖氨酸的存在），肽链呈舒展溶解状态。当溶剂中的盐离子浓度增加时，盐离子屏蔽了侧链中的电荷，肽链发生折叠，形成β-发夹，进一步自组装形成水凝胶。由于MARG1凝胶原纤维层一侧带有丰富的阳离子电荷，因此具有显著的抗菌活性，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等的抗菌效果明显，且具有易注射等优点，因此用于杀菌或预防潜在感染。

2.2 药物递送系统

自组装多肽可以作为活性药物治疗疾病或修复受损的器官及组织，也可以作为药物递送的载体将疏水性药物递送到指定部位后自身降解为安全无毒的代谢物。利用自组装多肽的疏水基团可以将药物或多肽本身穿透细胞膜进入细胞内从而提高活性成分的生物利用度，同时通过多肽表面的配受体相互作用可以将活性成分靶向至特定部位。Cheetham的团队［19］将 tau蛋白的衍生肽与抗肿瘤药物喜树碱相结合，这种具有两亲性的复合物可以通过疏水相互作用和分子间的氢键作用而形成稳定的纳米结构，有效提高了喜树碱的溶解性与选择性，从而发挥其药效。

Zhang等［20］将细胞穿膜肽TAT作为紫杉醇的递送材料进行研究，结果发现当TAT上结合的辛酸数量最多时，该自组装多肽载体的疏水性最高，能够有效包封抗癌药物紫杉醇，使其被递送至肿瘤细胞，是一种高效的药物递送手段。

2.3 其他应用

自组装多肽在一定条件下可以形成含水量较高的水凝胶，因为水凝胶的比表面积较大，为细胞的增殖与分化创造了较好的环境，同时，凝胶内部的网络结构可以通过一些小分子营养物质或代谢产物，与正常细胞所处的微环境相似。由于以上优点，自组装多肽水凝胶可以应用到组织工程中，作为细胞培养的支架和基质材料。自组装多肽因其具有良好的水溶性以及生物相容性还可以作为无机纳米材料的模板，在模仿生物矿化的过程（生物体内无机矿物的形成过程，如骨骼、结石的形成等）中制备出无机纳米材料如二氧化硅纳米材料等。此外，自组装多肽还可应用于再生医学、伤口愈合、稳定膜蛋白以及三维组织印刷等领域［15］。

3 凝胶形成机制

如上所述，水凝胶是由亲水聚合物组成，含有大量水分的三维网络结构的宏观体现［21］。在多种凝胶体系中，多肽水凝胶因其合成的多样性、较强的凝胶能力、良好的生物相容性及生物活性是最佳的生物功能材料之一，可应用于细胞培养、组织工程、药物递送、肿瘤治疗、再生医学等生物医药领域。

目前，设计优良的合成肽通常可以形成能够通过对外界刺激的反馈进行自组装结构微调的功能性水凝胶。自组装多肽水凝胶的形成是一个分段的过程［22］：溶液中的多肽分子首先形成特殊的二级结构如α-螺旋、β-折叠、β-发夹或卷曲螺旋（见图2），再经过一定程度的外部刺激或是适当的物理条件处理后，自组装形成纳米纤维，随着时间或浓度的增加，三维空间中的纳米纤维逐渐变厚、变长，从而形成纤维网络的结构，水分子被包裹在多肽的网络结构中，宏观上就形成了具有一定机械强度的水凝胶。设计出性质优良的环境响应性多肽水凝胶体系首先需要深入了解形成水凝胶的机制以及自组装多肽分子内部的相互作用，其主要的4种分子作用机制分别是疏水作用、π-π堆积、氢键作用以及静电作用。

3.1 疏水相互作用

多肽可以通过多种非共价相互作用形成水凝胶或其他有序的超分子结构。研究表明当多肽中的氨基酸与较大的芳香基团结合后更易形成水凝胶。我们可以通过在相同的多肽或氨基酸上连接不同的化学偶联物来比较芳香基团在多肽形成水凝胶（尤其是低分子水凝胶）的作用，如有报道称用9-芴甲氧羰基保护的酪氨酸（Fmoc-Tyr）可以轻易发生自组装从而形成水凝胶，但将Fmoc保护基换成非芳香族的叔丁氧羰基（Boc）或芳香性较弱的苄醇保护基（Cbz）时，水凝胶将无法形成。Subhasish等［23］利用芳香族间的相互作用设计出一种苯丙氨酸衍生物，它是一种由苯丙氨酸与芳香基团（芴基、萘基、萘氧基或肉桂基）结合而成的一种高效的凝胶剂，研究表明即使是芳香性最小的肉桂基也提供了足够的疏水作用使苯丙氨酸形成水凝胶剂。此外，Ou团队［24］还研究了四肽（Gly-Pheo-Phep-Tyr）在不同芳香基团的修饰下形成水凝胶的情况。研究表明，与Nap（2-萘乙酸）或PTZ（吩噻嗪）基团相比，用Cbz-修饰的多肽的成胶性能较弱，Cbz-Gly-Phep-Tyr能够形成凝胶的最低质量浓度为5%，用Fmoc-和Nap-修饰的多肽的最低成胶浓度为0.08 wt.%,而用PTZ修饰的四肽在质量浓度为0.01%的情况下即可形成稳定的水凝胶。

图2 自组装多肽形成不同二级结构示意图：(a)β-折叠，(b)β-发夹，(c)α-螺旋，(d)卷曲螺旋

3.2 π-π相互作用

有报道称，与Gly-Ala-Ile-Leu相比，Gly-Phe-Ile-Leu具有更好的成胶性能，为了研究芳香族残基在多肽形成水凝胶自组装过程中的作用，Xu等［25］着重研究了Fmoc-Tyr形成凝胶的机制，研究发现多肽形成水凝胶存在4种可能的驱动模式，其中一种就是Fmoc-基团与酪氨酸的苯基发生π-π堆积作用。此外，一些对Fmoc-Phe-Phe超分子结构以及Fmoc-Ala-Ala自组装的研究中发现π-π堆积在多肽形成水凝胶的自组装过程中起着至关重要的作用，用Fmoc-DAla-DAla水凝胶进行的分子动力学模拟实验也表明了π-π堆积是水凝胶形成的一个重要驱动力。

3.3 氢键作用

α-螺旋是蛋白质和多肽类结构中的一个重要二级结构类型，通常是由多肽主链缠绕成右手螺旋形成，每圈含有3.6个氨基酸，也是一部分多肽水凝胶内部存在的主要结构之一。在α-螺旋中，主链内部的稳定主要由第i位的羰基氧和第i+4位的N-H-形成的氢键来稳定。与β-折叠的结构不同，α-螺旋中的氢键属于分子内的相互作用，所以结构单元不是连续的［26］。多肽α-螺旋中的氢键作用力与疏水作用、范德瓦尔斯力一起对整体结构起到稳定作用，使得所形成的水凝胶更加稳定。

3.4 静电作用

除了以上所述的几种作用力，另一种促使多肽形成凝胶的作用力是多肽带相反电荷分子之间的静电作用。Xu等［27］研究了3种多肽（Val-Arg-Gly-Asp-Val，Gly-Arg-Gly-Asp-Gly，Lys-Lys-Arg-Gly-Asp-Lys）的成胶情况发现，当把这3种多肽的任意两种水凝胶在pH为中性的水溶液中混合时，由于静电作用促进自组装的形成从而形成超分子水凝胶。与其他作用力诱导的成胶相比，以静电作用为主要驱动力的多肽水凝胶即使其内部结构较大时也较易形成［28］。

4 结语

虽然环境响应性自组装多肽水凝胶与其他生物功能材料相比具有可降解性、生物相容性及合成的多样性等优点，但是也存在一些局限，如与其他聚合物水凝胶相比，多肽水凝胶的机械强度较低，需要提高水凝胶在体内的稳定性；多肽合成的成本较高，尤其是含有特殊氨基酸和特殊结构的多肽分子合成难度较高，不太适合批量化生产。在今后的发展中，研究可以通过改变多肽的结构从而改善多肽水凝胶的性质，并与其他功能材料相结合，取长补短，使其具有更加广泛的应用。