柱前衍生反相高效液相色谱法测定田菁种子水解液中的单糖

张倩男， 徐方敏， 连之娜， 李 鑫， 勇 强

(南京林业大学 化学工程学院，江苏 南京 210037)

田菁(Sesbaniacannabina)属于蚕豆科，是一种耐盐、耐涝、耐贫瘠的一年生草本植物，也是盐碱地改良的先锋植物，广泛分布于我国江苏、浙江沿海滩涂地区，同时也是优良的工业胶原料、动物饲料及秸秆绿肥[1-2]。田菁种子中含有丰富的黏性多糖物质，主要是由半乳甘露聚糖、葡聚糖以及少量木聚糖等组成。半乳甘露聚糖是一种天然水溶性多糖，由β-1,4-糖苷键连接的D-甘露糖骨架随机被单个单元β-1,6- 糖苷键连接的D-半乳糖残基取代，半乳甘露聚糖酶水解可制备半乳甘露低聚糖。甘露低聚糖具有增殖以双歧杆菌为代表的肠道有益菌、改善肠道菌群结构，以及增强机体免疫力等多种生理功能[3-5]。随着糖类分析方法的发展，目前用于分析单糖的主要色谱方法有气相色谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法(HPLC)及高效阴离子交换色谱安培检测法等。然而，这些分析方法都有许多缺点。比如，单糖分子需要通过复杂的过程转化成具有高热稳定性的挥发性衍生物，才能进行气相色谱分析[6]。薄层色谱法[7]样品处理繁琐、鉴别能力不强，已逐渐被仪器分析方法所代替。高效阴离子交换色谱安培检测法[8]在分析过程中需要使用较高pH值的流动相，对设备的要求较高。HPLC法[9]用于单糖组成分析时具有分离速度快、分辨率高、重现性好等优点，但由于单糖不吸收紫外光，无法直接使用紫外或荧光检测器，需要经过柱前或柱后衍生化以提高HPLC的分离选择性和检测灵敏度。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生是在分析前使用温和的反应条件衍生单糖，不产生立体异构产物，利用反相高效液相色谱法检测，灵敏度高，比其他衍生方法应用更广泛[10-11]。本研究采用柱前衍生反相HPLC法测定源于田菁种子的4种单糖，包括甘露糖、半乳糖、葡萄糖和木糖，以PMP为衍生化试剂，在碱性条件下与多糖水解产生的单糖定量缩合生成单糖-PMP衍生物，通过对衍生条件的优化以及色谱分离条件的考察，建立了田菁多糖的单糖组成分离测定方法，以期为单糖组分的测定提供理论指导。

1 实 验

1.1 原料、试剂与仪器

田菁种子购自中国江苏省连云港市，样品购买后经低温烘干、机械粉碎后过孔径0.150 mm筛，置于常温通风处保存备用。半乳甘露聚糖粉末、β-甘露聚糖酶酶液(3.24 U/mL)，由南京林业大学生物化工研究所提供；微晶纤维素(纤维素质量分数为92%，纤维素结晶度为72%)，洋槐豆胶(半乳甘露聚糖质量分数为56%)，D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖(分析纯)，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(分析纯)，美国Sigma-Aldrich公司；磷酸二氢钾、三氯甲烷(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；乙腈、甲醇均为色谱纯；其他试剂无特殊注明外，均为分析纯。实验用水为去离子水或纯水。

Agilent 1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司； mLS-3020高压灭菌锅，SANYO公司；SHA-B恒温振荡器，常州国华电器有限公司；Ledend Mach 1.6R型离心机，美国Thermo Fisher公司；Classic系列超纯水设备，法国ELGA LabWater公司。

1.2 标准单糖混合溶液的制备

精密称取标准单糖(甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖)适量，溶解在含有10%甲醇的水溶液中，制备成标准单糖溶液(质量浓度均为2.0 g/L)。用去离子水适当稀释标准单糖溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。所制备的溶液在使用前均储存在4 ℃，避光保存。

1.3 实验方法

1.3.1β-甘露聚糖酶酶活测定 在25 mL刻度试管中加入0.9 mL洋槐豆胶底物溶液，50 ℃预热5 min，加入0.1 mL适当稀释的酶液，于50 ℃下反应30 min后，立即加入3.0 mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂终止反应，随后沸水浴中处理7 min，冷却后定容到25 mL，充分摇匀，于540 nm下测定反应混合物的吸光度，并根据吸光度与还原糖的相关关系，计算反应生成的还原糖的浓度。1个β-甘露聚糖酶活力单位(U)以每分钟水解底物产生1 μmol还原糖(以甘露糖计)所需β-甘露聚糖酶的酶量进行计算。

1.3.2田菁种子的酶水解 称取一定量粉碎的田菁种子粉末于酶解瓶中，加入适量的β-甘露聚糖酶，在pH值5.0、50 ℃和150 r/min下水解72 h，反应结束后，置于100 ℃沸水中灭活10 min，冷却至室温，10 000 r/min离心10 min，上清液即为酶水解液。

1.3.3半乳甘露聚糖的酸水解 称取一定量半乳甘露聚糖样品置于烧杯中，加入蒸馏水溶解。取1 mL 半乳甘露聚糖溶液于离心管内，加入1 mL 8%的H2SO4，于121 ℃酸水解1 h。反应结束后加入质量分数50%的NaOH溶液中和，用适量蒸馏水稀释，即得半乳甘露聚糖酸水解液，备用。

1.3.4PMP衍生化 取标准单糖溶液、半乳甘露聚糖酸水解液和田菁种子酶水解液各150 μL，与150 μL 0.3 mol/L的氢氧化钠溶液、150 μL 0.5 mol/L的PMP-甲醇溶液均匀混合，于60 ℃，80 r/min恒温水浴锅内反应80 min。取出，冷却至室温，加入150 μL 0.3 mol/L的盐酸中和过量的氢氧化钠至pH值为7，加水稀释至3 mL，再加入等体积的三氯甲烷溶液，振荡静置，弃有机层，萃取3次，除去过量的PMP。取上层水相稀释至适当浓度， 0.22 μm微孔滤膜过滤，进行HPLC分析。

1.4 色谱分析方法

采用Agilent 1260型高效液相色谱系统分析PMP衍生化的单糖，该系统由G1329B自动进样器(0.1～100 μL)、G1311C四元泵、G1316A柱烘箱(273～333 K)和G1314B-UV检测器(190～950 nm)组成。色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，紫外检测波长250 nm，进样量10 μL。流动相A为100%乙腈，流动相B为0.02 mol/L KH2PO4缓冲溶液，梯度洗脱条件为：0 min→10 min→30 min，其中流动相A乙腈为15%→ 20%→25%。

2 结果与讨论

2.1 PMP衍生化条件的优化

2.1.1PMP用量 在反应时间80 min、反应温度60 ℃和三氯甲烷萃取次数3次的条件下，PMP用量对4种单糖衍生化的影响见图1(a)。由图可知，随着PMP用量的增加，各单糖的峰面积先增加后减少。当PMP 用量为100 μL时，葡萄糖的峰面积达到最大值，而甘露糖、半乳糖、木糖在PMP用量为150 μL 时有最大峰面积。由于PMP用量过高会使单糖峰面积减少，而且会导致衍生结束后萃取不完全，浪费试剂。因此，PMP用量选为150 μL。

2.1.2反应时间 在PMP用量150 μL、反应温度60 ℃和三氯甲烷萃取次数3次的条件下，反应时间对4种单糖衍生化的影响见图1(b)。由图可知，当反应时间超过40 min时，随着反应时间的延长，各单糖的峰面积不断增加，在反应时间为80 min时，各单糖峰面积达到最大；继续增加反应时间，各单糖峰面积反而下降，说明反应时间的延长并不利于衍生反应的充分进行，反而导致一些不明副产物的生成[12]。因此，反应时间选为80 min。

2.1.3反应温度 在PMP用量150 μL、反应时间80 min和三氯甲烷萃取次数3次的条件下，反应温度对4种单糖衍生化的影响见图1(c)。由图可知，各单糖的峰面积随衍生温度的升高而逐渐增大。当温度为60 ℃时，除葡萄糖外，各单糖峰面积达到最大，而葡萄糖在70 ℃时有最大值，继续升高反应温度，各单糖峰面积呈下降趋势，这可能是由于反应中衍生产物发生分解导致峰面积下降。由于本研究主要是针对田菁种子酶解液中的甘露糖和半乳糖组成建立一种稳定的分析测定方法，因此最佳反应温度选为60 ℃。

2.1.4萃取次数 在PMP用量150 μL、反应温度60 ℃和反应时间80 min的条件下，三氯甲烷萃取次数对4种单糖衍生化的影响见图1(d)。由图可知，随着萃取次数的增加，PMP残留量不断降低，当萃取次数为3次时，PMP残留量较低，此时各单糖峰面积达到最大。继续增加萃取次数，色谱图上已无PMP峰，但单糖-PMP衍生物的峰面积有所减小，这是由于PMP萃取过度，造成单糖-PMP衍生物的损失。因此，三氯甲烷萃取次数选为3次。

a.PMP用量PMP dosage; b.反应时间reaction time; c.反应温度reaction temperature; d.萃取次数extraction times图1 不同条件对各单糖峰面积的影响Fig.1 Effects of different conditions on peak area of monosaccharide

2.2 色谱分析条件的优化

2.2.1流动相选择 不同流动相的种类、配比、pH值等对高效液相色谱出峰的保留时间、峰形和分离度都有影响，因此选择合适的流动相是至关重要的[13]。对比分析了乙腈/水、乙腈/乙酸、乙腈/磷酸二氢钾和甲醇/磷酸二氢钾4种流动相体系对4种标准单糖混合物的HPLC色谱，结果见图2。以乙腈/水作为流动相(图2曲线a)，色谱峰峰形较差，且葡萄糖、半乳糖、木糖未实现有效分离。乙腈/乙酸的体系虽然改善了峰形，各峰之间的分离度均大于1.5，但葡萄糖和半乳糖完全重叠(图2曲线b)。而由图2曲线d可知，乙腈/磷酸二氢钾的流动相体系实现了4种标准单糖混合物的较好分离，这是由于乙腈的极性较大，洗脱能力强，实现了4种单糖的有效分离。因此，综合考虑选择乙腈/磷酸二氢钾(pH值6.5)作为流动相。

2.2.2乙腈比例确定 采用C18柱进行PMP柱前衍生化高效液相色谱分析时，乙腈的比例是重要的影响因素[14]。通过调节乙腈的比例，在相同的时间梯度(0 min→10 min→50 min)条件下，设置乙腈洗脱梯度分别为15%→15%→20%(方法a)、15%→20%→25%(方法b)、15%→25%→30%(方法c)，研究对上述4种单糖保留时间及分离效果的影响，结果见图3。由图3可知，方法a中乙腈比例小于20%，4种单糖保留时间较长且色谱峰较宽；方法c中乙腈比例大于25%，4种单糖的保留时间较短，但分离效果较方法b降低。方法b中4种单糖的色谱峰分离度较好，分布均匀，色谱峰尖锐且对称。因此，基于乙腈/磷酸盐缓冲溶液(pH值6.5)的流动相体系，乙腈的洗脱梯度为15%→20%→25%(0 min→10 min→30 min)，分析时间在30 min以内。

2.3 单糖PMP高效液相色谱分离

选取混合单糖标准溶液、半乳甘露聚糖酸水解液和田菁种子酶水解液进行PMP衍生化，C18反相HPLC分析其单糖组分(图4)。

a.乙腈/水acetonitrile/water; b.乙腈/乙酸acetonitrile/acetic acid;0 min→10 min→30 min: d.乙腈acetonitrile/KH2PO4

图2 不同流动相条件下样品的HPLC色谱图

Fig.2 HPLC chromatogram under different mobile phase conditions

1.PMP； 2.甘露糖mannose； 3.葡萄糖glucose； 4.半乳糖galactose； 5.木糖xylose

a.15%→15%→20%;c.甲醇methanol/KH2PO4; b.15%→20%→25%; c.15%→25%→30%

图3 不同乙腈配比下样品的HPLC色谱图

Fig.3 HPLC chromatogram under different acetonitrile ratios

如图4(a)所示，衍生试剂PMP最先出峰，对其他单糖测定结果无明显干扰，4种单糖的衍生物在25 min内实现良好分离。通过对样品中色谱峰保留时间与混合标准单糖溶液色谱峰保留时间的对比，半乳甘露聚糖酸水解液(图4(b))中的单糖由甘露糖和半乳糖组成，其物质的量之比约为1 ∶0.62，与Pollard等[15]文献报道的结果一致。图4(c)显示，田菁种子酶水解液主要由甘露糖和半乳糖组成，另外含有少量的葡萄糖和木糖，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的物质的量之比为1 ∶0.44 ∶1.92 ∶0.53。然而，与标准溶液色谱图对比，田菁种子酶水解液中还存在未知色谱峰。根据还原糖衍生化后的色谱行为规律推测，这些未知色谱峰可能是寡糖[16]。

1.PMP； 2.甘露糖mannose； 3.葡萄糖glucose； 4.半乳糖galactose； 5.木糖xylose a.混合单糖标准溶液mixed monosaccharide standard solution; b.半乳甘露聚糖酸水解液acid hydrolysate of galactomannan; c.田菁种子酶水解液enzymatic hydrolysate of S. cannabina seed图4 不同样品的HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of different samples

2.4 方法学考察

2.4.1标准曲线的绘制 精密吸取一定量混合单糖标准品溶液，置于10 mL容量瓶中，蒸馏水定容，配制成一系列不同质量浓度的混合溶液，在相同色谱条件下取10 μL注入高效液相色谱仪进行测定。记录色谱图，以单糖质量浓度(mg/L)为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，计算线性回归方程，以3倍信噪比计算得出这4种单糖的检测限，结果见表1。由表1可知，4种单糖的标准曲线R2均大于0.999 4。

2.4.2重复性实验 按照1.2节方法配制质量浓度为2.0 g/L的标准混合溶液，然后根据1.3.4节方法对标准混合溶液进行衍生化后进样，连续进样5次，记录各单糖每次的峰面积，计算5次所得峰面积的RSD值，结果见表2。由表2可知，4种单糖的RSD值均为0.25%左右，表明该方法的重复性良好。

表1 4种单糖线性方程和线性范围

2.4.3稳定性实验 按照1.2节方法配制质量浓度为2.0 g/L的标准混合溶液，然后根据1.3.4节方法对标准混合溶液进行衍生化后进样，分别在制备后0、3、6、12和24 h后进样，每个样品进样1次，记录各单糖每次的峰面积，计算5次所得峰面积的RSD值，结果见表2。由表2可知，4种单糖的RSD值在0.07%～0.31%之间，表明标准混合溶液在24 h内稳定。

2.4.4精密度实验 按照1.2节方法配制质量浓度为2.0 g/L的标准混合溶液，然后根据1.3.4节方法对标准混合溶液进行衍生化后进样。在0、3、6、12和24 h分别进样5次，记录各单糖每次的峰面积，得到标准混合溶液的日内精密度。连续测定5 d相同条件下的日间峰面积精密度，结果见表2。由表2可知，4种单糖日内精密度的RSD值在0.09%～0.15%之间，日间精密度的RSD值在0.04%～0.41%之间，表明该方法精密度良好。

表2 各单糖重复性、稳定性和精密度实验的RSD值(n=5)

2.4.5回收率实验 分别精确称取一定量的田菁种子酶水解液和半乳甘露聚糖酸水解液，定量加入标准混合溶液，测定并计算各单糖的加样回收率以及RSD值，结果见表3。由表3可知，半乳甘露聚糖酸水解液中4种单糖的加标回收率为97.3%～103.5%，RSD值为0.82%～0.85%；田菁种子酶水解液中4种单糖的加标回收率为96.9%～104.8%，RSD值为0.24%～0.56%，表明该方法的回收率较高，准确度良好。

表3 半乳甘露聚糖酸水解液和田菁种子酶水解液的加样回收率(n=5)

2.4.6样品含量的测定 分别精确称取一定量的半乳甘露聚糖酸水解液和田菁种子酶水解液，根据1.3.4节方法对各混合溶液进行衍生化后进样，连续进样5次，记录各单糖每次的峰面积，取各单糖峰面积的平均值代入相应标准曲线的线性回归方程，计算出相应的浓度及物质的量之比，结果如下：半乳甘露聚糖酸水解液中的单糖由甘露糖(0.53 g/g)和半乳糖(0.59 g/g)组成，其物质的量之比约为1 ∶0.62；田菁种子酶水解液中甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖分别为0.07、0.03、0.12和0.04 g/g，物质的量之比为1 ∶0.44 ∶1.92 ∶0.53。

3 结 论

3.1通过PMP柱前衍生化高效液相色谱法，建立了利用高效液相色谱-紫外检测器和反相C18柱分析田菁种子酶水解液中单糖的分析方法。考察了不同色谱分析条件和衍生化条件对单糖衍生物峰面积的影响，结果表明：最佳的色谱分析条件为以乙腈/磷酸二氢钾缓冲溶液(0.02 mol/L，pH值6.5)为流动相；最佳的衍生化条件为PMP用量150 μL、反应时间80 min、反应温度60 ℃和三氯甲烷萃取3次。此条件下，各单糖组分的峰面积较大、分离效果较好。

3.2方法学考察结果发现：4种单糖组分标准曲线的R2均大于0.999 4，加标回收率为96.9%～104.8%，相对标准偏差(RSD)小于0.56%，重复性、稳定性和精密度实验结果良好，说明该实验条件下建立的方法有效可信。通过该方法测得田菁种子酶水解液中甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的物质的量之比为1 ∶0.44 ∶1.92 ∶0.53。

3.3该方法操作简便、快捷，重现性好，可以使样品中4种单糖(甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖)得到较好的分离，并可定性、定量分析田菁种子酶水解液中单糖组成及物质的量之比。柱前衍生反相高效液相色谱弥补了传统高效液相色谱不能分离检测木糖、半乳糖和甘露糖的不足，可望推广应用于其他多糖的单糖组成研究。本研究结果对田菁种子酶水解液中半乳甘露低聚糖以及其他功能性低聚糖的研究具有一定的指导意义。