TAZ诱导性过表达慢病毒载体的构建、鉴定及诱导过表达TAZ神经母细胞瘤细胞株的建立

阮红峰，应忠明，罗 环

(1.浙江中医药大学附属第一医院骨伤研究所，浙江 杭州 310053；2. 台州中西医结合医院神经内科，浙江 台州 317200；3. 浙江大学医学院附属第二医院，浙江 杭州 310009)

神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)是儿童最常见且致死性极高的实体肿瘤之一[1]。由NB所致死亡人数占所有儿童肿瘤死亡总数的15%[2]。分子靶向治疗是近年肿瘤领域研究的热点[3]。TAZ是一个包含WW-domain结构域的转录共激活子，参与多种肿瘤细胞的增殖、调控肿瘤转移，并能预测部分肿瘤患者的预后情况[4]。针对Oncomine肿瘤数据库NB肿瘤组织的生物信息学分析发现，TAZ基因在NB肿瘤组织中呈高表达，且随着NB的恶化，表达逐渐升高。而TAZ是否参与NB的形成及恶化尚未完全明确。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株 人NB细胞株SH-SY5Y由浙江大学药学院陈忠教授惠赠；慢病毒包装细胞293T购自于ATCC细胞库。

1.1.2试剂 KOD Plus NEO高保真酶购自Toyobo公司；G418、嘌呤霉素和强力霉素(DOX)购自Sigma公司；实时定量PCR试剂盒购自宝生物公司。

1.1.3仪器 凝胶电泳、qPCR分析仪和Western blot系统(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1pLVX-TRE3G-TAZ质粒的构建 通过设计无缝克隆TAZ引物(Tab 1)，KOD Plus NEO高保真酶扩增TAZ序列。无缝连接至诱导过表达载体pLVX-TRE3G。连接产物经DH5α感受态转化、涂板和氨苄抗性筛选，挑选克隆进行菌液PCR，阳性进一步送测序，测序结果通过DNAMAN软件进行比对。

Tab 1 Primers for cloning TAZ fragments

1.2.2TAZ慢病毒的包装和细胞转导 将pLVX-TRE3G-TAZ及pLVX-Tet3G分别与慢病毒包装质粒sPax、VSVG共转293T细胞，制备慢病毒LV-TAZOE和LV-control用于感染SH-SY5Y细胞，48 h后加入G418(300 mg·L-1)和嘌呤霉素(1 mg·L-1)筛选96 h，获得稳定生长的SH-SY5Y细胞系。

1.2.3TAZ表达水平的验证 给予上述获得细胞系添加DOX(200 μg·L-1)诱导48 h，通过设计TAZ定量检测引物(Tab 2)，利用实时定量PCR和Western blot实验分别对该细胞TAZ的mRNA和蛋白表达水平进行验证。

Tab 2 Primers for qPCR assay

2 结果

2.1TAZ条件性过表达质粒的构建及鉴定为构建TAZ条件性过表达慢病毒质粒，利用高保真酶扩增获得1233 bp的TAZ目的片段，将其连接至BamHI/MluI双酶切的pLVX-TRE3G载体，连接产物经挑取相应克隆，经PCR鉴定阳性后，进一步测序比对分析，表明成功获得诱导性过表达TAZ质粒pLVX-TRE3G-TAZ。

2.2 诱导性过表达TAZ的SH-SY5Y细胞株的建立和验证利用上述构建pLVX-TRE3G-TAZ包装慢病毒LV-TAZOE感染SH-SY5Y，经抗生素筛选获得稳定的细胞株。qPCR实验表明，LV-TAZOE组细胞，在DOX诱导48 h后，其TAZ的mRNA水平是对照组的10倍(P<0.01)。与此类似，Western blot实验发现，DOX诱导后LV-TAZOE组SH-SY5Y细胞TAZ蛋白含量显著增多。上述结果表明，我们成功获得可诱导TAZ过表达的SH-SY5Y细胞株。

3 讨论

HIPPO信号参与肿瘤各种生物学行为是近年的研究热点，其关键下游转录共激活因子TAZ是调控细胞增殖和凋亡、组织再生、器官大小的关键因子，是多种肿瘤发生、发展相关的潜在靶向标记物[5]。本研究通过将TAZ克隆到诱导性过表达慢病毒载体pLVX-TRE3G并制备慢病毒感染SH-SY5Y成功获得条件性诱导过表达TAZ的SH-SY5Y细胞，为后续进一步深入研究TAZ是否参与NB的形成及恶化提供了关键的材料。