龙胆泻肝汤对人HaCaT细胞STAT3信号通路的调控研究

孙淑娜，魏海峰，许博涵，杨冠群，周煜，周曙杰，梁晨希，吴国境，张晓杰

（1.山东中医药大学附属医院，山东济南250011；2.山东中医药大学，山东济南250355；3.山东大学基础医学院，山东济南 250014）

龙胆泻肝汤源自《医方集解》，是临床中常用方剂之一[1]。原方由龙胆草、栀子、黄芩、泽泻、木通等十味药物组成，龙胆草为君，栀子、黄芩为臣，其余为佐，诸药同行，共奏清泻肝胆实火、清利肝经湿热的功效。近年来，该方广泛用于临床实践，对银屑病也展现出较好的疗效[2]，但其作用的分子机制尚不清楚。表皮角质形成细胞增殖异常是银屑病皮损处病理特征之一[3]。本研究利用人永生化表皮细胞HaCaT，分析了龙胆泻肝汤对表皮形成细胞凋亡的影响以及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株人永生化表皮细胞 HaCaT细胞株购于武汉大学中国典型培养物保藏中心。

1.1.2 主要试剂 龙胆泻肝汤：龙胆草6g、黄芩9g、山栀 9 g、泽泻 12 g、车前子 9 g、生地黄 20 g、当归8 g、柴胡10 g和甘草6 g。DMEM培养基、胰蛋白酶与胎牛血清：Gibco公司。Western blot用一抗：CST公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗：Abcam公司。STAT3荧光素酶报告质粒：上海碧云天生物技术有限公司，内参质粒pRL-TK内参质粒：Promega公司，Lipofectamine 2000：Thermo Fisher公司，RIPA裂解液与细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司，Trizol：Thermo Fisher公司。cNDA逆转录试剂盒：天根生化科技有限公司。Light Cycler 480 SYBR Green I Master：ROCHE公司，双荧光素酶报告检测试剂盒，Promega公司。PCR引物：上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 主要仪器 生物安全柜（苏净安泰，型号：BSC-1600IIA2）、CO2培养箱（Thermo，型号：3111）、倒置显微镜（OLYMPUS，型号：CKX53）、实时定量PCR仪（ROCHE，型号：LightCycler480Ⅱ）超低温冰箱（Thermo，型号：702）、微孔板发光检测仪（Berthold，型号：LB960）低温高速离心机（Thermo）、电子天平：Startorius公司，型号：BSA2202S）

1.2 方法

1.2.1 龙胆泻肝汤药液制备 取龙胆泻肝汤中药成分加相当于药材量10倍体积的去离子水浸泡2 h，回流提取1 h并过滤，药渣再加10倍量去离子水继续提取1 h，合并2次滤液，浓缩定容至每mL相当于1 g的原中药材的药液，离心去渣，过滤除菌，4℃冰箱保存备用。细胞培养时稀释到相应终浓度。

1.2.2 细胞培养 HaCaT细胞株在含有10%胎牛血清的DMEM培养液中于37℃、5%CO2贴壁培养，隔天换液。待细胞融合约90%时，吸去培养液，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，加入适量胰酶，37℃放置5 min，吸掉胰酶，加入相当2倍体积胰酶的培养液终止消化，反复吹打并转移至15 mL离心管，800转/min，离心3 min，弃上清，细胞沉淀重悬后以1∶3的比例接种到新培养瓶中。实验时取状态较好的对数生长期细胞。

1.2.3 细胞转染 将细胞铺到96孔板中，24 h后细胞密度达到约90%。参照说明，分别加入适量无血清无抗生素的培养基，Lipofectamin 2000转染试剂和质粒混合物（STAT3质粒与pRL-TK质粒9∶1混合）混匀，室温放置10 min。将配制好的Lipofectamin 2000转染试剂和质粒混合物（STAT3质粒与pRL-TK质粒9∶1混合）加入到细胞生长的培养板或培养皿中。

1.2.4 双荧光素酶活性测定 按照Promega公司提供的双荧光素酶报告基因分析系统说明书进行操作。吸去培养液，PBS冲洗细胞1次，每孔加入被动裂解液（PLB）细胞裂解液 20 μL，反复吹打，冰上放置10 min，再吹打细胞，收集细胞裂解液，通过生微孔板发光检测仪进行双荧光素酶活性测定。以萤火虫荧光素酶的活性与海肾荧光素酶活性的比值表示被检测的质粒在转染细胞后所测得的实际荧光素酶的相对活性。实验重复4次。

1.2.5 细胞总蛋白提取 将药物处理的HaCaT细胞吸除培养液，用PBS冲洗2次；细胞刮刷刮瓶底细胞，然后用移液器将细胞碎片转移至1.5 mL EP管中，4℃、5 000转/min、离心 5 min，弃上清，使用RIPA裂解液冰上裂解提取细胞总蛋白。

1.2.6 核蛋白的提取 细胞核蛋白的提取参照说明书。主要步骤为收取细胞沉淀，按10倍体积细胞沉淀量加入细胞浆蛋白抽提试剂A。最高速剧烈旋涡震荡5 s，冰浴10 min，加入细胞浆蛋白抽提试剂B，最高速剧烈旋涡震荡5 s，4℃、12 000转/min、离心5 min，上清至1个预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。向细胞沉淀加入细胞核蛋白抽提试剂B，最高速剧烈旋涡震荡30 s，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1～2 min再高剧烈旋涡震荡30 s，共30 min。12 000转/min离心15 min，上清即为抽提得到的细胞核蛋白。

1.2.7 Western blot 根据所测蛋白浓度，取40 μg样品变性后进行SDS-PAGE电泳，转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，使用含5%脱脂奶粉TBS室温封闭 1 h，一抗（稀释度为 1∶1 000）4 ℃孵育过夜，洗膜缓冲液（TBST）洗膜，二抗（稀释度为 1∶10 000）室温孵育1 h，洗膜，电化学发光（ECL）化学发光，显影定影，胶片曝光。曝光结果使用Image J软件进行光密度扫描和定量分析。

1.2.8 实时定量聚合酶链反应（PCR） 将药物处理的HaCaT细胞使用Trizol法裂解提取RNA并参照说明书逆转录。实时定量PCR检测，每个样品设3个复孔。每10 μL反应体系包括去离子水4.2 μL、cDNA 模板 0.5 μL、SYBR Green I Master Mix 5 μL、逆转录引物（上下游各 5 μmol/L）0.3 μL，反应条件：94℃预变性 3 min，95℃变性 30 s，60℃退火 30 s，72度延伸30 s，共40个循环。以GAPDH为内参，应用Roche LightCycler 480自带分析程序基因的表达。引物序列 qGAPDH-F：5’-CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT-3’，qGAPDH-R：5’GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3’；qSTAT3-F：5’-CAGCAGCTTGACA-CACGGTA-3’，qSTAT3-R：5’-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3’。

1.3 统计学分析 结果使用GraphPad Prism 5.0进行数据图像处理。统计资料使用SPSS12.0软件进行分析处理，采用单因素方差分析，组间数据应用t检验分析评价，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 龙胆泻肝汤抑制HaCaT细胞STAT3总蛋白以及磷酸化蛋白表达 为了明确龙胆泻肝汤对HaCaT细胞内STAT3通路的影响，笔者首先利用Western blot检测了龙胆泻肝汤处理后HaCaT细胞内STAT3的表达。龙胆泻肝汤处理HaCaT细胞48 h后，提取总蛋白检测。结果显示与对照组相比，龙胆泻肝汤处理后细胞内活性STAT3的标志-Try705磷酸化STAT3的水平有明显降低，同时总STAT3蛋白量也下降，且Try-705和总STAT3蛋白下降的程度随龙胆泻肝汤浓度的增加而增加，显示龙胆泻肝汤可以抑制人角质形成细胞内STAT3的表达，且抑制作用呈浓度依赖性，见图1。

图1 龙胆泻肝汤抑制HaCaT细胞内总蛋白水平以及磷酸化STAT3水平的表达

2.2 龙胆泻肝汤抑制HaCaT细胞内STAT3蛋白的入核 STAT3磷酸化激活后，需要进入细胞核发挥转录因子功能，激活下游靶基因的表达。为了明确龙胆泻肝汤是否能够抑制STAT3在细胞核内的含量，笔者提取了龙胆泻肝汤处理HaCaT细胞的核蛋白进行Western blot。结果显示与对照组相比，龙胆泻肝汤处理48 h的细胞核内STAT3表达显著降低，提示龙胆泻肝汤可以抑制STAT3在细胞核内的表达，见图2。

图2 龙胆泻肝汤抑制HaCaT细胞核内STAT3的表达

2.3 龙胆泻肝汤抑制HaCaT细胞内STAT3的转录活性 随后笔者又将启动子含有STAT3结合原件的荧光素酶报告载体转染入HaCaT细胞，利用荧光素酶报告基因检测系统分析龙胆泻肝汤对STAT3转录活性的影响。结果显示与预期相符。与对照组相比，龙胆泻肝汤处理组细胞内STAT3报告载体的荧光素酶活性明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01），提示龙胆泻肝汤可以抑制HaCaT细胞内STAT3转录活性，见图3。

2.4 龙胆泻肝汤对STAT3 mRNA表达的影响 利用实时定量PCR，笔者分析了龙胆泻肝汤对STAT3 mRNA表达的影响。结果显示，与对照组相比，龙胆泻肝汤处理后48 h，HaCaT细胞内STAT3 mRNA的有略微的升高，但差异无统计学意义（P=0.35），见图4。

图3 龙胆泻肝汤对STAT3转录活性的影响

图4 龙胆泻肝汤对STAT3 mRNA表达的影响

3 讨论

银屑病的发病是在遗传和环境的共同作用下，体内的免疫系统、神经系统和生物化学物质功能紊乱，由异常分化增殖的角质形成细胞和T细胞、树突状细胞等免疫细胞相互作用导致的免疫相关性疾病[4-6]。在银屑病发生和发展阶段，角质形成细胞既是细胞因子作用的重要靶细胞，又是细胞因子产生的重要细胞[7]。皮损处浸润的活性T细胞能够产生肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素（IFN）-γ、白细胞介素（IL）-17以及IL-22等细胞因子，诱导KC异常增殖和分化；同时，激活的角质形成细胞又会分泌IL-1b，IL-6、IL-8、TNF-α、趋化因子（CXCL）1 等细胞因子、趋化因子以及抗菌肽，进一步招募T细胞、中性粒细胞和单核细胞等免疫活性细胞迁移到炎性反应部位，使炎性反应级联放大[5-7]。所以，角质形成细胞的过度增殖及分化和功能异常是导致银屑病重要的原因之一，亦是银屑病治疗的重要靶点。

龙胆泻肝汤裁自《太平惠民和剂局方》，有泻肝胆实火，清下焦湿热之功效。该方对银屑病也展现出较好的疗效[2]。笔者之前的研究显示龙胆泻肝汤能够抑制HaCaT细胞的增殖，诱导细胞出现G1期停滞和细胞凋亡，导致Cyclin D1和磷酸化RB蛋白表达下降。本研究显示龙胆泻肝汤能够显著抑制细胞内STAT3的转录活性。Cyclin D1是STAT3的转录底物之一。笔者之前发现龙胆泻肝汤可导致HaCaT细胞内Cyclin D1的转录水平显著下降。因此本研究提示龙胆泻肝汤可能通过抑制STAT3通路，调控Cyclin D1在细胞内的表达并进一步调控细胞周期的进程。

STAT信号通路在包括细胞增殖，分化以及功能维持等多个生物学过程中均发挥着重要的功能，其异常可导致包括肿瘤和自身免疫性疾病等多种疾病的发生。炎性因子如IL-22，IL-23通过结合并激活相应细胞膜受体，进而磷酸化并激活酪氨酸激酶蛋白（JAK）。激活的JAK可以发挥激酶功能，进一步磷酸化并激活STAT蛋白，导致后者形成同源或异源二聚体，进入细胞核与相应DNA元件结合，激活下游基因的表达[8]。STAT家族共包括7个成员，其中STAT3主要参与体内Th17细胞反应[9]。鉴于Th17细胞在银屑病发病中的关键作用[10-11]，因此STAT3被认为与银屑病发病最为密切。研究显示银屑病患者皮损处无论是总蛋白水平还是磷酸化STAT3水平都要显著高于正常皮肤，并且角质形成细胞内高表达活性STAT3可导致小鼠出现典型银屑病样病征[12-13]。STAT3通路是治疗银屑病的重要靶点之一，目前针对此通路的药物在前期临床试验中也展现了其良好的应用前景[9，14-15]。因此笔者的研究提示STAT3是龙胆泻肝汤治疗银屑病的关键靶点之一，龙胆泻肝汤通过抑制角质形成细胞内STAT3通路的活性发挥银屑病治疗的功效。

本研究还发现，龙胆泻肝汤可显著抑制STAT3的总量。那么龙胆泻肝汤是否是通过抑制STAT3总蛋白的表达量实现其对功能的抑制？除了对蛋白表达的调控，龙胆泻肝汤是否也直接影响STAT3的磷酸化过程？其具体机制如何？此外，与靶向药物相比，中药成分复杂，其作用呈现出多层次、多靶点的特点，较单一作用靶点的药物相比有低毒、高效的优势。那么除了STAT3，角质形成细胞内是否还存在其他龙胆泻肝汤的作用靶点？这些问题还有待医者们进一步探讨。