低负荷加压训练改善自发性高血压大鼠的血压效果及机制研究

谭朝文，赵 彦，俞莹莹，马晓缓，郑玉婵

（1.南京体育学院 研究生部，江苏 南京 210014；2.南京体育学院 运动健康学院，江苏 南京 210014）

高血压是发病率极高的心血管疾病，常易引发动脉粥样硬化、心力衰竭等疾病。在其发病过程中，内皮细胞功能起到重要的作用，而有氧或抗阻训练能够有效地改善内皮功能障碍（Moraes-Silva et al.，2017）。

加压训练作为一种新兴的抗阻训练方式，通过可调节压力袖带造成肢体的血管血流短时受限，同时结合低负荷训练，为不适合高负荷训练但需要增加肌力的人群提供了一种可替代的方案，并且这种训练方案已被证明安全可行（Boeno et al.，2018；Sato，2005）。低负荷加压训练能够改善老年女性心脏功能，有效降低绝经后老年女性血压等（Ladlow et al.，2018；Naderi et al.，2018；Törpel et al.，2018；Yu et al.，2018），并且对高血压患者是安全可行的（Boeno et al.，2018）。老年人群采用低负荷加压训练方式可经血管内皮生长因子、血管紧张素Ⅱ等介导，对闭塞后血流、微血管容量、心脏功能等产生有益影响，能够促进血管生成（Naderi et al.，2018；Raji et al.，2018），但类似研究针对高血压慢病的研究较少。

已有研究证明，有氧运动（连续步行、慢跑和骑自行车）及抗阻运动能够通过调控内皮素-1、血管内皮生长因子、一氧化氮合成酶表达水平，对内皮功能产生积极影响，改善高血压患者血压，并促进心血管健康（Boutcher et al.，2017；Fang et al.，2019；Viboolvorakul et al.，2014）。但低负荷加压训练这种新的运动模式，能否通过该途径改善内皮细胞功能，进而达到降压效果还有待研究。

本研究探究低负荷训练、低负荷加压训练及高负荷训练对自发性高血压大鼠血压的影响，并对其降压效果进行比较，分析血液中内皮素-1、血管内皮生长因子、一氧化氮合成酶，以及心肌中内皮型一氧化氮合成酶指标的变化，探讨可能的降压机制，为进一步应用此运动模式治疗高血压提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取4周龄体重200 g左右、清洁级的雄性自发性高血压大鼠60只（由南京江宁区青龙山动物饲养基地提供）。大鼠分笼饲养，用国家标准啮齿类动物饲料进行饲养，自由饮食和进水。动物实验室的温度为20±3℃，相对湿度为30%～45%，按照昼夜节律采用电脑自动模拟日光光照，光照时间为8：30—20：00。动物饲养符合南京体育学院动物伦理委员会的相关规定。

1.2 实验分组

所有大鼠于4周龄购进，经适应性喂养1周后随机分为4组：对照组（高血压安静组）15只、低负荷训练组15只、低负荷加压训练组15只、高负荷训练组15只（Boeno et al.，2018；Ladlow et al.，2018；Picón et al.，2018）。

1.3 运动方案

运动组在大鼠梯架上进行训练，梯架每个台阶间隔0.5 cm，共有54个垂直台阶，台阶顶部有一休息平台，为动物在攀登休息时创造一个平稳环境。在最大负荷试验之前，所有大鼠进行连续5天的无负重适应性爬梯行为。试验包括初始负荷为体重的75%，将负荷附着于大鼠尾部基部，负荷在随后的爬升中逐步增加50 g。使用每只大鼠的个体最大负荷（最后一次完全爬升的负荷/体重）的标准化值进行阻力锻炼训练，并每周根据动物体重进行调节（在饲养与训练过程中，大鼠体重及力量随时间明显增加，为了保证高负荷训练组负荷的1 RM百分比达到55%～75%，低负荷训练组与低负荷加压训练组负荷的1 RM百分比达到35%～55%，同时结合国外学者研究（Sanches et al.，2013），采取负荷逐渐增加的抗阻训练方式（表1）。

表1 运动组8周的训练中的最大负荷（1 RM）Table 1 1 RM for 8 Weeks in Exercise Group /g

正式训练时，运动组进行8周爬梯训练，每周训练5天，每天15：00—17：00训练 1组爬梯，每组 15次，通过刺激大鼠尾尖方式使其在10 s内完成单次爬梯，每次间隔休息1 min，每周固定时间进行体重与最大负荷的测量（图1）。

图1 低负荷加压训练组自发性高血压大鼠爬梯过程与右下肢环扎部位示意图Figure 1.Schematic Diagram of the Ladder Climbing Process and Ligation Site of the Right Lower Limb of the Blood Flow Restriction Combined with Low Load Training Rats

低负荷加压训练：每周训练5天，第1～2周，最大负荷的30%～40%；第3～5周，最大负荷的40%～50%；第6～8周，最大负荷的40%～60%。在爬梯同时，选用橡皮筋环扎大鼠右下肢大腿根部，给予血管血流受限结合抗阻训练，在间歇1 min时，解除血流限制进行血流再灌注，休息后重新进行橡皮筋环扎该部位。为了更好监测血流受限程度，采用小动物高频彩色超声（VisualSonics公司，加拿大）于环扎后、间歇期、再次环扎时分别监测血流，以达到血流受限训练需求的30%～40%血流限制百分比（Deschenes et al.，2011；Mathien et al.，1986；Yang et al.，1991）（图2）。实验过程中随时检查大鼠状况，特别要注意运动组大鼠，防止运动中的意外受伤以及坏疽的发生。

低负荷训练：每周训练5天，第1～2周，最大负荷的30%～40%；第3～5周，最大负荷的40%～50%；第6～8周，最大负荷的40%～60%。

高负荷训练：每周训练5天，第1～2周，最大负荷的50%～60%；第3～5周，最大负荷的60%～70%；第6～8周，最大负荷的70%～80%（表2）。

1.4 大鼠尾动脉无创血压测定

在江苏省医药动物实验中心进行大鼠尾动脉无创血压测定，测试要求在安静、温暖的环境下，大鼠需保持清醒，用智能无创血压测试仪BP-2000（软隆生物公司，北京）测量大鼠安静时的尾动脉血压，每只大鼠连续测3次，取其平均值。测量时间为训练前、训练4周时、训练8周后的对应周的周六9：00—11：00。

图2 自发性高血压大鼠右下肢血流受限的超声检测Figure 2.Ultrasonic Detection of Blood Flow Limitation in the Right Lower Limb of Spontaneously Hypertensive Rats

表2 抗阻训练方案Table 2 Resistance Training Program

1.5 ELISA法测定血液中内皮素-1、血管内皮生长因子、一氧化氮合成酶水平

大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.5 ml/100 g），麻醉开腹后用粗纱布去除腹部筋膜和其他组织，找到下腔静脉进行取血，促凝管取血5 ml，室温放置2 h，然后3 000 r/min离心20 min，取上清液，采用酶联免疫吸附法（ELISA），使用ELISA检测试剂盒（江苏凯基生物技术有限公司），按说明书步骤操作，检测血清中内皮素-1、血管内皮生长因子、一氧化氮合成酶水平，根据标准曲线计算指标水平。

1.6 Western blot检测心肌中内皮型一氧化氮合成酶水平

大鼠解剖后摘取心脏，用生理盐水进行灌注清洗，滤纸吸干后放于-80℃冷冻保存。实验时取大鼠心尖组织，置于液氮中研磨成粉状，然后加入细胞裂解液孵育30 min，以10 000 r/min低温（4℃）离心5 min，取上清液。用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度，计算调整上样量后，样品按4：1混合loading buffer，沸水浴5 min。8%SDS-PAGE分离蛋白质，转膜，封闭 1.5 h，加入一抗（anti-eNOS，1：1 000，Cell Signaling公司，美国；anti-GAPDH，1：1 000，Proteintech Group公司，美国），4℃孵育过夜，加入二抗（anti-rabbit IgG-HRP，1：10 000，Proteintech Group公司，美国）室温孵育 1.5 h，滴加 ECL，置于 Bio-Rad Chemidoc XRS+（Bio-Rad伯乐公司，美国）下进行曝光，用Image LabTM Software图像分析软件进行灰度分析。

1.7 统计学分析

统计数据采用M±SDM表示，组间比较采用SPSS 20.0进行单因素方差分析（one way-aNOVA）及t检验，组内采用配对t检验分析，P＜0.05为具有显著性差异，P＜0.01为具有非常显著性差异；采用pearson或spearman相关分析进行两变量间的相关分析。

2 结果

2.1 8周后自发性高血压大鼠体重变化

训练前，4组自发性高血压大鼠体重无明显差异（P＞0.05）；训练8周后，4组体重均明显增高（P＜0.05）。其中，与对照组相比，高负荷训练组体重明显增高（P＜0.05）；而低负荷加压训练组和低负荷训练组与对照组相比，体重无明显差异（P＞0.05，表3）。

2.2 不同方式抗阻训练对自发性高血压大鼠血压的影响

1）比较4组训练前后自身的变化，低负荷加压训练组和低负荷训练组的收缩压与舒张压显著下降（P＜0.05）；对照组的舒张压显著上升（P＜0.05）；高负荷训练组的收缩压与舒张压明显上升（P＜0.05）。2）组间对比，低负荷加压训练组在8周训练后，收缩压与舒张压均低于低负荷训练组（P＜0.05）；高负荷训练组在训练4周时，舒张压明显高于对照组（P＜0.05）；在8周训练后，高负荷训练组舒张压同样明显高于对照组（P＜0.05，表4、图3）。

表3 8周后4组自发性高血压大鼠体重变化Table 3 Weight Changes of Spontaneously Hypertensive Rats after 8 Weeks /g

2.3 不同方式抗阻训练对自发性高血压大鼠血液中内皮素-1、血管内皮生长因子、一氧化氮合成酶表达的影响

实验后运动组血液中指标均与对照组进行比较，以代替实验前血液提取检测。ELISA检测结果发现，1）与对照组比较，低负荷加压训练组和低负荷训练组内皮素-1表达水平显著下调（P＜0.05），高负荷训练组内皮素-1表达水平显著上调（P＜0.05）；2）与对照组比较，低负荷加压训练组、低负荷训练组、高负荷训练组的血管内皮生长因子表达水平均显著上调（P＜0.05）；3）与对照组比较，低负荷加压训练组与低负荷训练组一氧化氮合成酶表达水平显著上调（P＜0.05），高负荷训练组一氧化氮合成酶表达水平显著下调（P＜0.05，表5）。

表4 不同方式抗阻训练对自发性高血压大鼠血压的影响Table 4 Effects of Different Resistance Training on Blood Pressure in Spontaneously Hypertensive Rats /mmHG

2.4 不同方式抗阻训练对自发性高血压大鼠心肌中内皮型一氧化氮合成酶表达的影响

Western blot结果发现，1）与对照组比较，低负荷加压训练组与低负荷训练组内皮型一氧化氮合成酶表达水平显著上调（P＜0.05）；2）与低负荷训练组比较，低负荷加压训练组内皮型一氧化氮合成酶表达水平显著上调（P＜0.05，图4）。

2.5 相关性分析

Pearson数据相关性处理结果发现，1）在高负荷训练组中，只有收缩压与内皮型一氧化氮合成酶呈负相关（r=-0.881，P＜0.05）。2）在低负荷加压训练组中，收缩压与内皮素-1呈正相关（r=0.687，P＜0.05）；收缩压与一氧化氮合成酶呈负相关（r=-0.559，P＜0.05）；收缩压与血管内皮生长因子呈负相关（r=-0.577，P＜0.05）；收缩压与内皮型一氧化氮合成酶呈负相关（r=-0.927，P＜0.05）。3）在低强度抗阻训练组中，收缩压与内皮素-1呈正相关（r=0.776，P＜0.05）；收缩压与一氧化氮合成酶呈负相关（r=-0.796，P＜0.05）；收缩压与血管内皮生长因子呈负相关（r=-0.746，P＜0.05）；收缩压与内皮型一氧化氮合成酶呈负相关（r=-0.930，P＜0.05）；舒张压与一氧化氮合成酶呈负相关（r=-0.553，P＜0.05）；舒张压与血管内皮生长因子呈负相关（r=-0.703，P＜0.05）；舒张压与内皮型一氧化氮合成酶呈负相关（r=-0.931，P＜0.05，表6，表7）。

图3 不同方式抗阻训练对自发性高血压大鼠血压的影响Figure 3.Effect of Different Resistance Training on Blood Pressure in Spontaneously Hypertensive Rats

表5 不同方式抗阻训练对自发性高血压大鼠血液中内皮素-1、一氧化氮合成酶、血管内皮生长因子表达的影响Table 5 Effects of Different Resistance Training on the Expression of ET-1，NOS，and VEGF in the Blood of Spontaneously Hypertensive Rats

图4 不同方式抗阻训练对自发性高血压大鼠心肌中内皮型一氧化氮合成酶表达的影响Figure 4.Effects of Different Resistance Training on eNOS Expression in Myocardium of Spontaneously Hypertensive Rats

3 讨论

3.1 内皮相关因子对自发性高血压大鼠血压变化影响

高血压是一种原因尚不明确、以体循环动脉压升高为主要特征的独立性、全身性的疾病。除遗传因素外，不良的生活作息、饮食习惯等环境因素均会产生血流动力学负荷相关的生物力学应力，逐渐改变心血管功能，并在机械和体液因素的作用下，造成血管内皮细胞凋亡坏死，最终导致血管舒张/收缩功能障碍，引起机体血压升高（Berenyiova et al.，2018；Moreno et al.，2017；Pucci et al.，2019）。而在这一过程中，内皮功能的健全起到了关键作用（Suvorava et al.，2017）。

与内皮功能相关的因子主要包括：内皮素-1、血管内皮生长因子、一氧化氮合成酶。内皮素-1作为内皮功能障碍的潜在标志物，能够影响血管的有效收缩，与一氧化氮形成动态平衡，当内皮素-1表达水平降低时，高血压患者的收缩压降低（Gu et al.，2015）。血管内皮生长因子，对血管发生、形成及血管张力有着重要的良性作用，并且可以调节细胞迁移、增殖和血管收缩/扩张，触发内皮生物学所必需的途径（Wang et al.，2019）。一氧化氮合成酶，负责一氧化氮的生成，能够调节细胞增殖、血小板聚集、血管张力等，可以抑制血管、心肌纤维化，改善内皮细胞功 能（Battault et al.，2016；Li et al.，2019；Silva et al.，2016；Ülker et al.，2017），而内皮型一氧化氮合成酶则是在心肌中主要表达的一种一氧化氮合成酶的亚型，多为心肌组织检测中采用（Chang et al.，2017；Chao et al.，2017）。

表6 收缩压与内皮素-1、一氧化氮合成酶、血管内皮生长因子、内皮型一氧化氮合成酶的相关性Table 6 Correlation between SBP and ET-1，NOS，VEGF，eNOS

表7 舒张压与内皮素-1、一氧化氮合成酶、血管内皮生长因子、内皮型一氧化氮合成酶的相关性Table 7 Correlation between DBP and ET-1，NOS，VEGF，eNOS

当内皮功能发生障碍时，高血压发病进程加速，血液中内皮素-1表达逐渐升高，与一氧化氮的动态平衡被打破，血液中内皮素-1的变化与血压升高呈正比（Battault et al.，2016）。在对高血压人群或动物进行低中强度抗阻运动或低强度抗阻联合有氧运动干预后，血液中的血管内皮生长因子表达增加，并且血管内皮生长因子介导PI3K-Akt活化一氧化氮合成酶进行磷酸化，使一氧化氮合成酶大量表达，增加一氧化氮释放量，抑制并降低内皮素-1表达水平，重新控制血管收缩维持血管张力，引起血管壁结构发生重塑，改善内皮功能及动脉顺应性，进而降低血压（Colombo et al.，2016；Maruf et al.，2016；Son et al.，2017；Stanisic et al.，2019；Touyz et al.，2016；Viboolvorakul et al.，2014）。

3.2 单纯低负荷训练对自发性高血压大鼠血压变化影响及机制

在本实验中，单纯低负荷训练产生了降压效果，降压机制可能是由于内皮功能的改善。当单纯低负荷训练干预自发性高血压大鼠后，大鼠血液中的内皮素-1下调，血管内皮生长因子上调，一氧化氮合成酶上调以及心肌中内皮型一氧化氮合成酶上调，同时大鼠血压下降，并且低负荷训练组大鼠血压与内皮素-1成正相关，与血管内皮生长因子和一氧化氮合成酶及心肌中内皮型一氧化氮合成酶成负相关。这一系列结果与前人研究结果相一致（叶芳等，2016），证明单纯低负荷训练可以通过调节内皮相关因子激活释放一氧化氮，进行血管重塑，达到改善内皮功能，降低血压的目的。

3.3 低负荷加压训练对自发性高血压大鼠血压变化影响及机制

在原有的低负荷训练方案上，同时进行加压训练，实验结果显示，低负荷加压训练组自发性高血压大鼠降压效果显著优于低负荷训练组，降压机制可能是由于内皮功能的改善及心肌中内皮型一氧化氮合成酶大量表达。训练后，大鼠血液中的内皮素-1下调，血管内皮生长因子上调，一氧化氮合成酶上调以及心肌中内皮型一氧化氮合成酶上调，同时大鼠血压下降，低负荷加压训练组大鼠收缩压与内皮素-1成正相关，与血管内皮生长因子和一氧化氮合成酶成负相关。其中，低负荷加压训练组血液中内皮素-1、血管内皮生长因子、一氧化氮合成酶指标与低负荷训练组相比较，无明显差异，但低负荷加压训练组心肌中内皮型一氧化氮合成酶表达上调明显高于低负荷训练组，统计学意义极为显著，并且低负荷加压训练组大鼠收缩压与心肌中内皮型一氧化氮合成酶成负相关。这一系列结果与前人研究结果相似（Neto et al.，2015；Stanisic et al.，2019）。同时在对比低负荷训练组时发现，低负荷加压训练能更有效地增加心肌中内皮型一氧化氮合成酶的表达。当心肌中内皮型一氧化氮合成酶的表达提高时，一氧化氮释放，优先修复损伤血管，进行心肌纤维化抑制，只有在一氧化氮大量释放时才能形成足够多的新微血管，进而缓解改善血管张力，这可能是低负荷加压训练组降压效果优于低负荷训练组的原因所在（Chao et al.，2017；Li et al.，2015）。实验中，低负荷加压训练是在运动中完成的。而关于静态加压除压训练，部分研究证明，单纯静态加压除压训练对血管的剪切应力及对血流动力学的影响较低，虽然能够即刻降低血压，但不能长期使血压维持在低的水平上（Araújo et al.，2014；Pinto et al.，2018；Spranger et al.，2015）。所以，对于高血压慢病来说，低负荷加压训练在运动中的效果会远远优于安静状态下的加压除压训练。综上，本实验证明，低负荷加压训练可以通过调节血液中内皮相关因子改善内皮功能，并大幅度上调心肌中内皮型一氧化氮合成酶表达量，达到降低血压的效果，同时也说明低负荷加压训练降压效果不仅仅是低负荷抗阻的效果，还包括加压训练的效果。

3.4 高负荷训练对自发性高血压大鼠血压变化影响及机制

关于高负荷训练组，实验结果表明，高负荷训练产生了升高血压的效果。与低负荷训练组和低负荷加压训练组相比，高负荷训练组升压现象的出现，可能与训练后大鼠血液中的内皮素-1和血管内皮生长因子上调，一氧化氮合成酶下调有关。事实上，当进行65%1RM阻力训练时，会增加氧化应激水平，加重内皮功能障碍，引起血压较大波动，导致不良反应的发生（Sharman et al.，2015），本实验中高负荷训练升高血压现象与这一研究结果相似。而本实验高负荷训练组内皮素-1的表达上调和一氧化氮合成酶的表达下调，与Wang等（2019）的研究一致，高负荷运动带来的氧化应激会刺激内皮素-1增加，并抑制一氧化氮合成酶表达，这样的变化会影响内皮功能。但血液中的血管内皮生长因子表达水平相对于对照组虽有显著的提高，但相关性分析显示，该组收缩压、舒张压的变化与血管内皮生长因子无相关性。这可能与高负荷训练组训练后的乳酸过度堆积和交感神经兴奋性提高有关（Ozaki et al.，2013；Shimojo et al.，2015），并推测血管内皮生长因子表达上调是为了缓解高负荷训练对大鼠血管带来的压力，但还需要深入研究。因此，认为高负荷训练可以上调自发性高血压大鼠血液中血管内皮生长因子表达，但不能够取得降压的效果，说明不是单一因素控制。

4 结论

低负荷加压训练可以下调血液中内皮素-1的表达、上调血液中血管内皮生长因子和一氧化氮合成酶及心肌中内皮型一氧化氮合成酶的表达，改善血管内皮功能，降低自发性高血压大鼠血压，且降压效果优于单纯低负荷训练，为代替高负荷训练作为高血压疾病的运动方案提供了新思路。