HPLC同时测定葵树子中5种化学成分的含量

潘立卫，罗泽萍，黄秀香，覃芳芳

（1.河池学院化学与生物工程学院，广西宜州 546300；2.广西高校微生物及植物资源开发利用重点实验室，广西宜州 546300）

葵树子为棕榈科蒲葵属常绿乔木蒲葵（Livistona chinensis R.Br.）的种子，具有败毒抗癌、消瘀止血、软坚散结等功效，主治癥瘕积聚、慢性肝炎、血崩、外伤出血、食道癌、绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、白血病等（国家中医药管理局《中华本草》编委会，1999）。该药材有着良好的民间药用基础及丰富的药理活性，其在化学成分（黄月凤，2011；刘志平等，2007；国家中医药管理局《中华本草》编委会，1999；Unar，1997）、 抗癌作用 （王慧等，2008；Huang，2007；Susan，2005）、 抗氧化作用 （陈艳，2011）、生药学研究（詹晓如等，2012）、园艺栽培（朱洪武等，2011）、质量控制（刘国雄，2016）等方面都有研究。目前，采用液相色谱法对中草药定量多指标检测，为当今中药材含量测定一种发展趋势，能更有效地控制其质量。对于葵树子质量控制，目前使用HPLC 测定蒲葵药材中的指标成分有小麦黄素、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、苜蓿素、原儿茶酸、原儿茶醛等（刘国雄，2016；林菲娟等，2013；王慧，2008）。研究表明葵树子所含成分大多为酚酸和黄酮类（黄月凤，2011；刘志平等，2007；国家中医药管理局 《中华本草》 编委会，1999；Unar DM，1997），两大类成分在抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌、降血糖、提高免疫力上都发挥作用，可考虑作为添加剂，应用在食品、保健品和饲料加工等方面。本文采用HPLC 同时测定葵树子中原儿茶酸、绿原酸、异槲皮苷、山柰酚、芹菜素5 种化学成分的含量，旨在建立一种简便可行的同时测定葵树子中5 种成分含量的方法，为完善葵树子质量控制及制剂方面开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料 葵树子采于河池学院校园内，经河池学院化学与生物工程学院植物学实验室副教授鉴定为棕榈科蒲葵属植物葵树子的干燥种子。

1.1.2 仪器与试药 Agilent 1260 型高效液相色谱仪 （四元泵、VWD 检测器、 柱温箱、 自动进样器 ）；Agilent 1260 series色谱工作站；岛津AUW220D 型十万分之一天平；Agilent 8453 二极管阵列紫外可见分光光度计；Millipore D-Q3 超纯水机。对照品：原儿茶酸（110809-201205 中国食品药品检定研究院）；异槲皮苷（must-15070211成都曼思特生物科技有限公司）；山柰酚（20160328 北京坛墨质检科技有限公司）；芹菜素（lot-151228 成都植标化纯生物技术有限公司）；绿原酸（自制，HPLC 峰面积归一化法测定纯度大于98.0%），经理化性质和光谱数据分析，鉴定其结构；乙腈（色谱纯，美国天地）；水为纯净水；其余试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取原儿茶酸、绿原酸、异槲皮苷、山柰酚、芹菜素对照品适量，加入甲醇使其溶解，定容至100 mL，配制成每毫升含原儿茶酸0.025 mg、绿原酸0.030 mg、异槲皮苷 0.033 mg、 山柰酚 0.058 mg、 芹菜素 0.032 mg的混合对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备 葵树子打碎成粗粉，过筛（40 目）。使用具塞锥形瓶精密称取药材粉末50 g，精确移入70%乙醇液300 mL，密塞，称重，冷浸48 h，每隔4 h 振摇一次，补重滤过，取续滤液，经0.22 μm 微孔滤膜过滤即得。

1.2.3 色谱条件 ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）色谱柱，以乙腈（A）-0.2%磷酸（B）为流动相进行梯度洗脱（0～5 min，2%～8%A；5～10 min，8%～16%A；10～20 min，16%～20% A；20～25 min，20%～24% A；25～30 min，24%～30% A，30～36 min，30%～35%A，36～42 min，35%～45% A，42～50 min，45%～55%A），设定流速：0.6 mL/min，检测波长：263 nm，柱温：30 ℃，进样量：5 μL。

1.2.4 线性关系考察 精确吸取混合对照品溶液2、4、6、8、10、12 μL 按“1.2.3 项”色谱条件注入高效液相色谱仪。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，求得线性回归方程。

1.2.5 检测限与定量限 参照《中国药典》信噪比法，按信噪比为3:1 计算原儿茶酸、绿原酸、异槲皮苷、山柰酚、芹菜素的检测限；按信噪比为10:1计算原儿茶酸、绿原酸、异槲皮苷、山柰酚、芹菜素的最低定量限。

1.2.6 精密度试验 取同一混合对照品溶液重复进样6 次，每次5 μL，测定峰面积，按峰面积外标法计算含量，并计算日间精密度RSD。

1.2.7 稳定性试验 精密称取葵树子干燥药材粉末（40 目）50 g，按“1.2.2 项”下制备供试液，“1.2.3项”下室温放置 2、4、6、8、12 h 后注入高效液相色谱仪测定相应峰面积，按峰面积外标法计算含量，并计算RSD。

1.2.8 重复性试验 精密称取同一批葵树子干燥药材粉末（40 目）6 份，每份 50 g，按“1.2.2 项”下制备供试液，“1.2.3 项”下测定其峰面积，按峰面积外标法计算含量，并计算RSD。

1.2.9 加样回收率试验 精密称取6 份已知含量的葵树子供试品溶液5 mL，分别精密加入混合对照品溶液（含原儿茶酸0.025 mg/mL、绿原酸0.03 mg/mL、异槲皮苷 0.033 mg/mL、山柰酚 0.058 mg/mL、芹菜素 0.032 mg/mL） 5 mL，甲醇定容至 10 mL，按“1.2.3 项”下测定供试溶液，进样 5 μL，记录色谱峰面积，并计算样品的平均加样回收率和RSD。

1.2.10 样品含量测定 选取来自不同采集点的葵树子药材粉末（40 目）各约50 g，精密称定，共5份，按“1.2.2 项”方法制备样液，“1.2.3 项”测定供试样液，进样5 μL，测定5 批葵树子中5 种目标成分的含量，记录对照品、样品色谱图及峰面积，并用外标法计算各采集点葵树子中5 种成分含量平均值。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的线性考察结果 葵树子中原儿茶酸、绿原酸、异槲皮苷、山柰酚、芹菜素5 种化学成分进样量分别为 0.05～0.30、0.06～0.36、0.066～0.396、0.023～0.139、0.013～0.079 μg；各组分的回归方程及相关系数见表1，线性范围r＞0.999，表明各组分在相应进样量范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.2 检测限与定量限 按信噪比为3:1 计算原儿茶酸、绿原酸、异槲皮苷、山柰酚、芹菜素的检测限分别为 0.97、0.74、1.39、1.38、1.42 ng；按信噪比为10:1 计算原儿茶酸、绿原酸、异槲皮苷、山柰酚、芹菜素的最低定量限分别为 3.26、2.49、4.65、4.59、4.74 ng。

表1 线性关系测定结果（n=6）

2.3 精密度试验结果 测定原儿茶酸、 绿原酸、异槲皮苷、山柰酚、芹菜素峰面积，计算日间精密度。结果测得RSD 依次为1.14%、1.30%、1.37%、1.15%、1.24%，表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验结果 测定原儿茶酸、 绿原酸、异槲皮苷、山柰酚、芹菜素峰面积，计算5 种成分含量的 RSD 依次为 0.69%、1.96%、1.34%、1.01%、1.15%，说明被测供试品溶液在24 h 内表现出良好的稳定性。

2.5 重复性试验结果 根据测定原儿茶酸、绿原酸、异槲皮苷、山柰酚、芹菜素的峰面积，计算5 种成分含量的 RSD 依次为 0.62%、1.85%、0.97%、1.21%、1.37%，试验结果表明重复性良好。

2.6 加样回收率试验结果 由表2 可知，原儿茶酸、绿原酸、异槲皮苷、山柰酚、芹菜素的平均回收率分别为 101.60%、99.65%、96.36%、98.62%、100.62% ，RSD 分 别 为 1.93% 、0.86% 、1.43% 、1.12%、1.98%。说明采用HPLC 法测定葵树子中5种成分含量具有较好的准确性和可靠性。

表2 葵树子中5 种成分加样回收率（n=6）

2.7 样品含量测定结果 由图1 可知，5 种化学成分组间分离度均大于1.5，理论塔板数按各成分计算不少于3000，基本能将待测成分完全分离，达到色谱分离要求，柱效良好。测定5 批葵树子中5 种目标成分的含量，记录对照品、 样品色谱图（图1）及峰面积，并用外标法计算来自不同采集点的药材中5 种成分含量平均值，以mg/g 计，结果见表3。5 批葵树子中5 种成分含量分别为原儿茶酸2.67～1.85 mg/g、绿原酸 0.34～0.86 mg/g、异槲皮苷 0.72～1.17 mg/g、山柰酚 0.10～0.16 mg/g、芹菜素 0.024～0.059 mg/g。

图1 葵树子HPLC

表3 样品含量测定结果（n=5） mg/g

3 讨论

前期样品的制备，曾采用加热回流法考察了不同溶媒（甲醇、乙醇、水）浓度、提取温度、提取时间对提取率的影响，并分别制备葵树子供试品溶液，测定5 种指标成分的含量。结果发现，冷浸法提取效果最佳，在此提取条件下基本能把有效成分提取完全，得到成分种类较多、敏感成分破坏少、重现性较好。故本试验选择该方法作为提取条件。

试验考察了不同的流动相比例 （乙腈-0.1%乙酸、 乙腈-0.1%磷酸、 甲醇-0.1%乙酸、 甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、甲醇-0.2%磷酸）的等度和梯度洗脱分离效果，反复试验发现流动相为乙腈-0.2%磷酸梯度洗脱，5 种成分色谱峰形及分离效果最佳；不同色谱柱间的考察，结果发现使用Hypersil BDS C18 和ZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱分析效果较好，但由于ZORBAX E-clipse Plus C18 色谱柱为窄径柱，其柱效更高，分析时间更短，而且峰形更好，且考虑到溶剂成本及紫外灯能量损耗等因素，故最终采用ZORBAX Eclipse Plus C18 柱，流速为 0.6 mL/min 进行分析。在190～400 nm 范围内对混合对照品溶液和供试品中进行全波长扫描，选择最大吸收波长263 nm 做为测定波长，在该波长下基线稳定，分析灵敏度好。样品含量测定中不同采集点的试样含量各异，有可能与其生长环境和树龄相关。

葵树子在民间常用于多种癌症的治疗，效果明显。本试验选取该植物中原儿茶酸、绿原酸、异槲皮苷、山柰酚、芹菜素5 种成分做为指标进行含量测定，探讨和建立葵树子HPLC 含量测定方法，结果表明，该方法简便可行、准确可靠、灵敏度高、重现性好，为葵树子作为药材或饲料添加剂的质量控制提供参考及抗癌天然药物研究开发奠定基础。