孕穗期低温灌溉对水稻剑叶和颖花生理特征的影响

罗秋红,吴 俊,柏 斌,庄 文,姚栋萍,肖 贵,刘雄伦,邓启云,3

(1.湖南农业大学 农学院,湖南 长沙 410128；2.杂交水稻国家重点实验室,湖南杂交水稻研究中心,湖南 长沙 410125；3. 湖南袁创超级稻技术有限公司,湖南 长沙 410323)

近年来温室气体大量排放,导致全球气候变暖和极端高低温天气频现。水稻是我国主要的粮食作物之一,是喜温作物,对低温环境敏感。世界很多水稻种植区均受到过冷害胁迫,我国东北水稻种植区、华南及长江中下游水稻种植区的晚稻容易遭受寒冷低温胁迫,损害水稻的正常生长发育,降低水稻产量,造成巨大的产量损失[1]。相关研究表明,芽期温度低于8 ℃将导致水稻成苗率明显下降[2]。苗期低温会影响水稻生长发育,进而降低水稻产量[3]。孕穗期是水稻育性敏感期,研究认为孕穗期持续低温会造成水稻株高、穗长、结实率、千粒质量降低,对产量造成显著影响[4]。孕穗期冷水胁迫会造成抽穗期到成熟期干物质积累减少,并影响有机物质向不同部位的输送[5]。当前已从产量构成[6]、激素[7]、颖花育性[8]等不同角度对孕穗期低温胁迫进行了阐述,但仍未能明确水稻孕穗期受低温胁迫影响的关键形态生理指标。

本试验选取生产上大面积推广的水稻品种,在孕穗分化Ⅴ期(育性敏感期[9])模拟低温环境,17.5 ℃、10 d的低温冷水灌溉处理,对受低温影响后的功能叶和颖花的生理特征进行分析,以期比较不同水稻品种在孕穗期受低温胁迫的形态生理差异,明确孕穗期受低温胁迫影响的关键形态生理指标,为孕穗期耐低温品种的选育提供理论指导。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验选取4个在生产上大面积推广的优质、高产水稻品种：籼型杂交稻Y两优957、籼型杂交稻天优华占、籼型杂交稻Y两优1号、籼型常规稻中早39。

1.2 试验方法

1.2.1 栽培措施与田间管理 试验于2018年在湖南杂交水稻研究中心长沙马坡岭本部试验田进行。按湖南地区常规方法播种育秧,从5月21日开始播种,每隔10 d所有材料重复播种一次,共播种3次。插秧的密度为23.3 cm×23.3 cm,每穴插单苗,移栽时间分别6月15日、6月20日、6月30日。试验采取完全随机设计,单个播种批次单个品种种植300蔸(10×30),试验期间按中稻常规管理措施进行水分和病虫害管理。科学施肥,采取常规高产栽培施肥方法[10],氮肥总用量为180 kg/hm2, 氮、磷、钾配比为1.0∶0.6∶1.1。基肥中氮占总施氮量的30%,钾占总施钾量的40%,磷肥全作底肥；分蘖肥中氮占总施氮量的40%,钾占总施钾量的20%；穗肥中氮占总施氮量的30%,钾占总施钾量的40%,分促花肥(幼穗分化Ⅰ期) 和保花肥(幼穗分化Ⅳ期) 2次施用。

1.2.2 低温处理 待大田种植各品种生长至幼穗分化敏感Ⅴ期,分别选择主茎叶龄余数为0.9的植株各70株,移至35个塑料盆钵中,每盆2株水稻。随机分为低温处理组(CT,25盆)和对照组(CK,10盆),各播种批次重复处理1次,共处理3次。盆钵在自然条件下适应3 d后,将低温处理组置于冷水灌溉池17.5 ℃低温处理10 d,处理时期的光湿环境均为大田自然环境,10 d后,重新同对照组一起放置到自然条件下继续生长至成熟。

1.2.3 测定项目及方法 叶绿素SPAD值：在低温处理结束当天(第10天)用SPAD502测定剑叶SPAD值。每个品种选取长势较为一致的水稻植株6株,测定叶片中部、中部上端3 cm和中部下端3 cm,取其平均值。

花粉育性及结实率：低温处理组在低温处理结束当天,人工标记幼穗分化敏感Ⅴ期受到10 d低温胁迫的幼穗,此时水稻植株的叶枕距为-1～4 cm。对照组开花当日、低温处理组标记穗开花当日,分别随机选取3个已开花的幼穗,取中部未开花的颖花进行花粉镜检。用0.2% KI-I2溶液对花粉进行染色,在显微镜下观察并拍照,人工统计不育花粉比率。

待各材料成熟后,低温处理组随机选取20个标记穗,对照组随机选取20个成熟穗,人工数粒统计结实率,并计算冷害指数。冷害指数=(对照结实率-低温处理结实率)/对照结实率。

抗氧化系统生理生化指标：低温处理结束当天,分别取对照组与低温处理组剑叶各5片；随机选取水稻各一株取其处于幼穗分化幼穗Ⅵ和Ⅶ期的幼穗颖花,使用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(Elisa)试剂盒(上海优选生物YX系列产品)测定剑叶的超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性以及颖花的超氧化物歧化酶(SOD)活性。

渗透调节系统生理生化指标：低温处理结束当天,分别取对照组与低温处理组剑叶5片；随机选取水稻各一株取其处于幼穗分化幼穗Ⅵ和Ⅶ期的幼穗颖花,使用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(Elisa)试剂盒(上海优选生物YX系列产品)测定剑叶的脯氨酸(PRO)、可溶性总糖(STS)、可溶性蛋白(sPRO)含量；同时利用该方法测定幼穗颖花的PRO和STS含量及蔗糖合成酶(SS)活性等生理指标。

ABA含量：低温处理结束当天,随机选取水稻各一株取其处于幼穗分化幼穗Ⅵ和Ⅶ期的幼穗颖花,收集足量后,-80 ℃冷冻保存,各样品取3次重复。使用高效液相色谱串联质谱法(安捷伦1290高效液相色谱仪串联AB公司Qtrap 6500质谱仪),测定水稻幼穗颖花的内源激素ABA含量。

1.3 数据分析

所有数据均采用Microsoft Excel 2010软件进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 孕穗期低温胁迫对结实率的影响

结实率变化和冷害指数是水稻幼穗分化期受低温胁迫影响程度的直观表现。本研究发现孕穗期17.5 ℃、10 d低温处理后,4个水稻品种的结实率均有所下降,其中天优华占和Y两优957的结实率下降不显著,Y两优1号、中早39的结实率均表现为显著降低(表1)。因此,Y两优957和天优华占可作为低温耐受品种,Y两优1号和中早39可作为低温敏感品种。

表1 孕穗期低温对不同品种结实率的影响Tab.1 Effect of low temperature at booting stage on seed setting rate of different varieties

注：表中同行内不同小写字母表示不同处理之间差异达0.05显著水平。表3-4同。

Note：Values followed by different small letters within a line are significantly different atP<0.05.The same as Tab.3-4.

2.2 孕穗期低温胁迫对花粉育性的影响

在本研究中4个品种经过10 d低温处理后,不育花粉均比对照组增多(图1)。中早39不育花粉比例最大(表2),Y两优1号次之。即低温胁迫对中早39花粉育性影响最大,Y两优1号次之,对Y两优957和天优华占影响较小,这与结实率结果一致,说明结实率降低的重要原因之一是花粉育性下降。

2.3 孕穗期低温胁迫对剑叶SPAD值的影响

SPAD值可以衡量叶片叶绿素的相对含量[11]。在低温胁迫10 d后测定剑叶SPAD值发现,除低温耐受品种天优华占外,其他3个品种低温处理后剑叶的SPAD值均显著低于对照组(表3)。表明低温胁迫影响了水稻剑叶的光合作用,但SPAD值的显著下降与结实率的显著降低并不完全一致。

2.4 孕穗期低温胁迫对剑叶与颖花抗氧化系统酶活性的影响

低温胁迫会破坏植物细胞膜的结构,改变膜的透性、积累活性氧,破坏蛋白质、核酸等生物功能分子,引起代谢紊乱,影响正常的光合作用。植物组织中的SOD、CAT、POD可以清除活性氧,可作为衡量植物抗冷能力的指标[12]。低温胁迫后测定各品种剑叶与颖花抗氧化系统酶活性后发现：低温胁迫后,低温耐受品种Y两优957、天优华占剑叶SOD、CAT活性均显著高于对照,剑叶POD活性上升,天优华占上升达显著水平；而低温敏感品种则呈现出相反的趋势,剑叶SOD、POD活性低于对照,其中Y两优1号剑叶SOD活性显著下降,Y两优1号和中早39的POD活性降幅均达到显著水平； Y两优1号和中早39的剑叶CAT活性与低温耐受品种表现一致,均比对照高；颖花的SOD活性与剑叶的SOD活性变化相反,低温耐受品种颖花SOD活性显著低于对照,低温敏感品种颖花SOD活性显著高于对照(图2)。

A，B. Y两优957 CK、CT组；C，D. 天优华占CK、CT组； E，F. Y两优1号CK、CT组； G，H. 中早39 CK、CT组。比例尺：100 μm。 A，B. Yliangyou 957 CK, CT treatment; C，D. Tianyouhuazhan CK, CT treatment; E，F. Yliangyou 1 CK, CT treatment; G，H. Zhongzao 39 CK, CT treatment.Scale bar：100 μm.

表2 孕穗期低温对不同品种花粉育性的影响Tab.2 Effect of low temperature at booting stage on pollen fertility of different varieties

表3 孕穗期低温对不同品种叶绿素SPAD值的影响Tab.3 Effect of low temperature at booting stage on SPAD value of different varieties

2.5 孕穗期低温胁迫对剑叶与颖花渗透调节物质的影响

图中不同小写字母表示不同处理之间差异达0.05显著水平。图3同。Different small letters indicate significance between different treatments at P<0.05. The same as Fig.3.

植物细胞在遭受逆境后,会积累脯氨酸(PRO)、可溶性糖(STS)、可溶性蛋白(sPRO)等渗透调节物质,以增强细胞的持水能力[13],且许多参与代谢调节的酶均以可溶性蛋白的形式存在[14]。糖是主要的光合作用产物可合成淀粉等有机大分子,也是调节源库关系的重要信号分子[8]。综上所述,PRO、STS和sPRO含量及蔗糖合成酶(SS)活性均可用于衡量植物对于逆境的反应程度。

由图3-A可知,Y两优957、Y两优1号、中早39低温处理后剑叶PRO含量均高于对照,且中早39显著高于对照,天优华占低温处理后剑叶PRO含量显著低于对照。图3-B中,Y两优957、Y两优1号、天优华占低温处理后剑叶STS含量均高于对照,其中Y两优957、Y两优1号显著高于对照,中早39低温处理后剑叶STS含量较对照稍有下降。图3-C中,Y两优957低温处理后剑叶sPRO含量与对照相比变化不大,天优华占sPRO含量显著高于对照,Y两优1号、中早39的sPRO含量显著低于对照。

图3-D中可以看出,Y两优957、天优华占、中早39的颖花低温处理后其PRO含量均显著低于对照,而Y两优1号低温处理后颖花PRO含量显著高于对照。图3-E中,低温耐受品种Y两优957、天优华占低温处理后颖花STS含量显著低于对照；低温敏感材料Y两优1号、中早39的低温处理后颖花STS含量高于对照,且Y两优1号增幅显著。图3-F中,Y两优957、中早39低温处理后颖花的蔗糖合成酶(SS)活性低于对照,中早39降幅达到显著水平；天优华占和Y两优1号低温处理后颖花的SS活性均显著高于对照。

图3 幼穗分化敏感期低温对不同品种渗透调节系统的影响Fig.3 Effect of low temperature at booting stage on osmotic adjustment of different varieties

2.6 孕穗期低温胁迫对颖花ABA含量的影响

脱落酸(ABA)是调节非生物胁迫的重要激素,能诱导冷调控基因的表达[15],增强植物的抗寒能力。本试验分别选取低温耐受品种Y两优957和低温敏感品种中早39的颖花为试验材料,分析低温处理10 d后其颖花的ABA含量变化。从表4中可以看出,低温处理后,低温耐受品种Y两优957和低温敏感品种中早39的颖花ABA含量均显著高于对照。

表4 孕穗期低温对颖花ABA含量的影响Tab.4 Effect of low temperature at booting stage on ABA content ng/g

3 讨论

3.1 孕穗期低温对剑叶生理指标的影响

孕穗期低温会导致膜脂过氧化、积累活性氧[12],影响剑叶的光合作用[16]。在本试验中,4个品种剑叶SPAD值均较对照组低,表明低温处理会影响剑叶的光合作用,且在品种间存在差异。抗氧化系统能够有效地清除自由基,有利于保障植物组织的正常功能。在本研究中,低温耐受品种Y两优957、天优华占的剑叶SOD、POD、CAT活性上升,表明这2个品种在遭受逆境后抗氧化系统增强,减轻了细胞膜的受损,叶片作为能量源仍能提供足量的同化产物,减轻了低温胁迫对水稻颖花发育的影响；而低温敏感品种Y两优1号、中早39剑叶的SOD、POD活性低于对照,影响了剑叶正常提供足量的同化产物,导致水稻颖花发育不足；低温处理后4个品种的CAT活性均有所上升,与SOD和POD活性表现不同,说明不同抗氧化酶参与低温调控的作用和机理可能不同。

目前脯氨酸功能尚未完全明确,一般认为脯氨酸是重要的渗透调节物质,是合成蛋白质的原料[17]。低温耐受品种天优华占PRO含量在低温胁迫下显著低于对照,低温敏感品种中早39低温胁迫后PRO含量显著上升。前人研究发现脯氨酸含量的上升能提高马铃薯和小麦的耐低温能力,但在拟南芥中一些耐冷材料与敏感材料在低温胁迫后积累的脯氨酸含量都比较低[18]。在水稻三叶期的研究结果表明，敏感品种在低温、干旱、盐胁迫下会积累更多脯氨酸[19],说明脯氨酸含量与植物抗寒性并不呈正相关。对比4个品种剑叶的PRO含量与sPRO含量发现,二者变化趋势基本相反。白志英等[20]同样发现在干旱胁迫下,小麦孕穗期、开花期、灌浆期剑叶PRO含量与sPRO含量呈现负相关。而这一现象可能是可溶性蛋白在非生物胁迫下被分解形成了脯氨酸导致的,还需进一步设计试验进行验证。低温敏感品种与低温耐受品种在sPRO含量上的差异表现表明，可溶性蛋白可能有利于植物抵抗低温逆境。除中早39外的3个品种剑叶的可溶性总糖含量均比对照组高,其中低温敏感品种Y两优1号低温处理组与对照组差异最大,表明剑叶可溶性糖STS含量与抗寒性并不呈现正相关。而前人在粳稻中研究发现不同品种在分蘖期、孕穗期、灌浆期低温胁迫后,可溶性糖含量的变化与耐冷性呈现正相关[21],与本试验的结果不同,推测可能存在籼粳亚种间的差异。

3.2 孕穗期低温对幼穗颖花生理及育性的影响

孕穗期持续低温会导致结实率降低,且在不同品种间存在差异。本研究结合花粉镜检的结果可知结实率降低重要原因之一是由于花粉不育造成的,这一结论与前人研究结果相同[22]。SOD酶活性降低会影响活性氧的清除,但低温耐受品种低温处理后颖花的SOD酶活性显著低于对照,低温敏感品种则显著高于对照。低温胁迫处理后水稻剑叶和颖花SOD活性的变化呈现相反的趋势,PRO、STS含量也表现为这种趋势,低温耐受品种受低温胁迫后颖花PRO、STS含量显著低于对照。表明幼穗与剑叶在低温胁迫下的生理响应不一致,推测这些抗氧化酶和渗透调节物质在水稻植株上保持一个整体的平衡,外部环境刺激会导致物质在植物不同部位分布,从而影响植物整体的生长发育情况,这有待于进一步的试验验证。ABA 可以调控绒毡层内发的细胞死亡,是目前研究最清楚的参与低温胁迫信号转导的激素。本研究中低温胁迫后ABA含量显著高于对照。前人研究发现孕穗期低温胁迫后水稻叶片ABA含量上升,与本试验研究结果相似[23]。ABA可以传导胁迫信号,因此在逆境下会迅速增加ABA含量以抵御逆境伤害[13, 24]。

前人研究中多以剑叶生理指标作为耐冷指标[21],对小穗研究多集中于花药开裂、花粉萌发等方面,生理指标的研究较少涉及,本试验同时分析水稻剑叶和颖花在幼穗分化期受低温胁迫后的生理调控机理,发现SOD、PRO、STS等多个生理指标在剑叶和颖花中的表现不一致甚至相反,可能存在源库受外部环境影响后的一个动态平衡机制,该研究为孕穗期低温胁迫对水稻生理特征的影响提供了新的思路。